后天感染河南櫻桃谷鴨乙型肝炎病毒模型的建立*

臧利敏,吳學煒,趙雪杰,方先珍,楊曉瑞,王慶端,常俊標,鄭立運#

1)鄭州大學醫(yī)藥科學研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州安圖綠科生物工程有限公司 鄭州 450016 3)河南省動物疫病預(yù)防控制中心測報科 鄭州 450008

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是當今人們面臨的主要健康問題，全球約有4億人為慢性乙型肝炎感染者[1]。HBV宿主范圍狹窄，建立理想的HBV動物模型是有效篩選抗病毒藥物、研究HBV感染機制和發(fā)病過程的基礎(chǔ)[2]。鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)是一種禽類嗜肝DNA病毒，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組特征、生命周期、生物學特性等與HBV非常相似[3]。目前, DHBV模型已成為國內(nèi)外認可的抗HBV藥物體內(nèi)活性篩選和評價的動物模型。國內(nèi)已見報道的DHBV模型鴨主要有北京鴨、重慶麻鴨、廣州櫻桃谷鴨、湖北麻鴨等。通過雛鴨后天感染DHBV是建立模型的一個主要途徑，但是鴨體內(nèi)病毒血癥持續(xù)的時間及水平受鴨種、毒種、產(chǎn)地、感染途徑、感染劑量等多種因素影響，研究結(jié)果間存在一定差異。前期作者從河南本地櫻桃谷鴨血清中分離并克隆了一株DHBV標準毒株。該研究中，作者采用DHBV陽性血清人工感染3日齡河南櫻桃谷鴨，建立標準的人工感染河南櫻桃谷鴨乙型肝炎動物疾病模型，探討DHBV DNA在動物外周血和肝臟中的增殖規(guī)律，并觀察抗病毒藥物拉米夫定(3TC)鴨體內(nèi)的抗病毒效用，驗證該模型的科學性與實用性。

1 材料與方法

1.1動物與試劑1日齡河南省櫻桃谷鴨120只，雌雄不拘，體質(zhì)量(50±5) g，購買于河南省鄭州市新鄭宏達鴨業(yè)孵化公司；DHBV-WS病毒株(GenBank No:HM590411.1)由河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室分離和保存；DHBV標準質(zhì)粒由河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室構(gòu)建和保存；3TC為葛蘭素史克蘇州有限公司產(chǎn)品；SYBR Green Ⅰ染料購自寶生物工程(大連)有限公司；Viral DNA提取試劑盒和Tissue DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek(美國)公司。

1.2引物的設(shè)計根據(jù)GenBank收錄的DHBV S區(qū)核苷酸的保守序列設(shè)計引物，由北京博尚生物公司合成。上游序列：5’-CGGACAACGGGTCTACTAT-3’，下游序列：5’-GGTGGCAGAGGAGGAAGT-3’。

1.3DHBV陰性鴨的篩選1日齡河南櫻桃谷鴨120只，經(jīng)頸靜脈無菌采血400 μL， 3 000 r/min離心5 min分離血清，酚/氯仿法提取DNA。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL、模板0.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個循環(huán);72 ℃10 min。取PCR擴增產(chǎn)物在10 g/L 瓊脂糖凝膠上進行電泳，155 bp處無條帶判定為DHBV陰性鴨。

1.4DHBV模型鴨的建立1日齡DHBV陰性鴨48只，在3日齡時經(jīng)脛靜脈注射采用文獻[3]方法得到的拷貝數(shù)為1.6×106mL-1的DHBV陽性血清0.20 mL，于第0、2、4、6、8、10、12、14、21、28、35、42天隨機抽取，每次剖殺4只，分別按照Viral DNA提取試劑盒、Tissue DNA提取試劑盒說明書提取血清及肝臟DNA。

1.5熒光定量PCR檢測采用鄭州大學醫(yī)藥科學研究院藥化室已建立的DHBV熒光定量PCR方法[4]檢測血清和肝臟中DHBV DNA水平。 反應(yīng)體系為20 μL： SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物各0.4 μL，H2O 7.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性5 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸25 s，共40 個循環(huán)；40 ℃冷卻10 s。每個待測樣本同時檢測3管，取平均值。

1.6實驗分組與處理另取1日齡DHBV陰性鴨48只，設(shè)正常組、模型組與3TC組各16只。模型組與3TC組鴨在3日齡時經(jīng)脛靜脈注射拷貝數(shù)為1.6×106mL-1的DHBV陽性血清0.20 mL。7 d后，正常組與模型組灌服生理鹽水2 mL/(kg·d)，3TC組灌服3TC 20 mg/(kg·d)，共給藥10 d。分別在給藥5、10 d后及停藥3 d后隨機抽取，每次每組剖殺4只，按照試劑盒說明書提取血清及肝臟DNA，采用熒光定量PCR方法檢測血清和肝臟中DHBV DNA水平。根據(jù)公式計算DHBV DNA抑制率，抑制率(%)=(模型組拷貝數(shù)-3TC組拷貝數(shù))/模型組拷貝數(shù)×100%。

1.7肝臟病理學檢查用藥前、用藥10 d后處死正常組、模型組和3TC組實驗動物，后取肝左葉中部1.0 cm×1.0 cm大小肝組織固定于甲醛溶液，石蠟包埋、切片后HE染色，切片厚度為5 μm，光學顯微鏡下(×400)觀察肝組織病變。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0處理，不同組別不同時間點鴨血清和肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)的比較采用2×3析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DHBVDNA在模型鴨血清和肝臟中的增殖情況3日齡櫻桃谷鴨經(jīng)脛靜脈接種DHBV陽性血清后，血清和肝臟中DHBV DNA水平的變化見圖1。感染2 d后，48只雛鴨血清均可檢測出DHBV DNA;在第2至14天，病毒量隨著時間呈上升趨勢，并于感染后第14天達到高峰，拷貝數(shù)達到7.7×109mL-1；第14至42天，血清DHBV DNA水平呈緩慢下降趨勢；第6至42天，血清DHBV DNA拷貝數(shù)均維持在較高水平。肝組織中DHBV DNA含量的動態(tài)變化趨勢與血清中基本一致。

圖1 模型鴨血清和肝臟中DHBV DNA水平動態(tài)變化圖

2.2模型組和3TC組鴨血清和肝臟DHBVDNA的水平模型組和3TC組鴨用藥后血清和肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)比較結(jié)果見表1、2。3TC組在用藥第10天，血清和肝臟DHBV DNA抑制率分別達到86.5%和84.9%；停藥3 d后，DHBV DNA抑制率分別為79.7%和73.4%，即出現(xiàn)輕度的“反彈”現(xiàn)象。

表1 不同組別不同時間點鴨血清中DHBV DNA拷貝數(shù)(n=4)(×108 mL-1)

F組間=17.625，F(xiàn)時間=68.141，F(xiàn)交互=134.517，P<0.001。

表2 不同組別、不同時間點鴨肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)(n=4)(×108 mL-1)

F組間=69.430，F(xiàn)時間=35.330，F(xiàn)交互=75.770，P<0.001。

2.3各組鴨肝組織病理學觀察結(jié)果見圖2。正常組鴨肝細胞呈梭狀，結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰。用藥前，模型組與3TC組肝組織部分細胞腫脹和出現(xiàn)空泡，匯管區(qū)可見炎細胞浸潤及灶性壞死。模型組鴨肝臟在用藥10 d后出現(xiàn)胞質(zhì)疏松化、大量空泡、重度脂肪變性、水樣變性和灶狀壞死。與模型組相比，3TC組在用藥10 d后病變細胞明顯減少，炎癥有很大程度減輕。

3 討論

HBV具有明顯的種屬特異性，宿主范圍狹窄。已報道[5]的HBV模型動物主要有黑猩猩、樹鼩、土撥鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠、地松鼠、旱獺、鴨等。相比之下，鴨具有來源廣、價格低、易于飼養(yǎng)、繁殖率高、重復(fù)性好等優(yōu)點。目前國內(nèi)用于篩選評價抗HBV藥物的動物模型主要以DHBV模型為主。

DHBV模型建立的方法分為先天感染和后天感染兩種。國內(nèi)先天感染模型通常采用大批量篩選DHBV陽性鴨的方法[6-7]，所需樣本量較大，一般選用自然感染率較高的品種。前期調(diào)查研究[3]發(fā)現(xiàn)，河南省櫻桃谷鴨DHBV陽性率為8.1%，自然感染率較低，適宜建立后天感染模型。后天感染主要通過給1～3日齡雛鴨注射病毒陽性血清造成慢性攜帶狀態(tài)。研究[8]表明，雛鴨體內(nèi)免疫系統(tǒng)尚未成熟，容易形成免疫耐受，攻毒后病毒血癥持續(xù)時間長且穩(wěn)定。病毒血癥的水平與所感染的 DHBV 毒株毒力強弱有很大的關(guān)系。該模型中病毒株的來源為河南櫻桃谷鴨DHBV的一株分離株，其基因序列明確，易感性較高，經(jīng)脛靜脈注射后3日齡雛鴨感染率為100%。采用DHBV 1.6×106mL-1拷貝數(shù)陽性血清0.20 mL感染3日齡雛鴨，連續(xù)觀察42 d，發(fā)現(xiàn)可維持較高的病毒血癥而無明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象, 具有良好的穩(wěn)定性。其血清和肝臟中DHBV DNA分別在14、21 d達到高峰，在42 d內(nèi)保持較高的水平。與鄧學龍等[9]報道的廣州櫻桃谷鴨模型相比，病毒血癥持續(xù)時間更長。胡權(quán)等[10]建立的湖北麻鴨乙肝模型，采用DHBV DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞上清感染雛鴨，第7天出現(xiàn)病毒血癥，第11天達到峰值，第33天開始逐漸下降，與該研究結(jié)果也有一定差異?？笻BV藥物篩選動物實驗中，用藥時間一般為10～15 d，該模型血清和肝臟中DHBV DNA 連續(xù)觀察42 d均維持較高水平，能夠滿足實驗需求。

圖2 鴨肝組織病理切片(HE，×400)

該研究采用抗HBV藥物3TC對模型進行驗證，進一步證明了模型的可靠性。3TC是第一個用于治療乙肝的經(jīng)典核苷類藥物，1999年在中國上市。該藥物具有明確的藥理作用，能夠有效地抑制HBV DNA的復(fù)制[11]，改善肝組織病理狀態(tài)。由實驗結(jié)果可知，與模型組相比，3TC組鴨用藥后血清和肝臟中不同時間的DHBV DNA拷貝數(shù)均有明顯下降，在用藥10 d后，血清和肝臟DHBV DNA抑制率分別達到86.5%和84.9%。而且可觀察到用藥10 d后3TC組鴨肝病理狀態(tài)得到明顯改善。因此，該模型可作為理想的DHBV后天感染疾病模型，為后期HBV的研究和抗HBV藥物的篩選和評價奠定基礎(chǔ)。

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