雷帕霉素對p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染的EC9706細胞增殖的影響*

魯照明，楊 帥，周媛媛，貝維娟，侯桂琴

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase-related kinase，PIKK)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種進化上保守的蛋白激酶，也是一種重要的信號轉(zhuǎn)導分子，參與多種病理和生理過程，是細胞生長的中心調(diào)控因子[1-2]。許多研究[3-5]證明，mTOR有望成為腫瘤治療中重要且有前景的分子靶點，其抑制劑如雷帕霉素及其衍生物目前正在許多腫瘤中進行臨床前及臨床研究，如宮頸癌、乳癌、腎細胞癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及小細胞肺癌等。核糖體蛋白S6激酶 (ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR最重要的底物之一，被mTOR磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)控制含5’Top結(jié)構的mRNA的翻譯起始，是蛋白合成中重要的調(diào)控因子[6]。食管鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)是世界六大常見腫瘤之一，惡性程度高，5 a存活率低于5%[7]，在發(fā)展中國家尤為常見。作者以p70S6K特異性小片段干擾RNA (p70S6K-siRNA) 轉(zhuǎn)染人食管鱗癌EC9706細胞，分析轉(zhuǎn)染前后雷帕霉素對細胞增殖的影響，為人食管鱗癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑EC9706購自上海中科院細胞庫，胰蛋白酶和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基和標準胎牛血清購自美國Hyclone公司，雷帕霉素購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，Taq酶、dNTP和DNA Marker購自大連寶生物公司，對照siRNA(無義對照siRNA)、p70S6K-siRNA、HRP標記羊抗兔IgG及GAPDH抗體、p70S6K(C-18)抗體及p-p70S6K(Thr421/Ser424)兔抗人多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。p70S6K上游引物：5’-ATGCTGCTTCTCGTCT GG-3’，下游引物：5’-TTGAGTCATCTGGGCTGT-3’，擴增產(chǎn)物長度為204 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3’，下游引物：5’-AG GTCCACCACTGACACGTTG-3’，擴增產(chǎn)物長度為570 bp。引物由上海捷瑞公司合成。

1.2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染EC9706細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。細胞以1×105個/孔接種在6孔板中，加RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。當細胞融合度達到80%～90%時，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染細胞，并于轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下進行RNA干擾效率的檢測，同時用未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對照siRNA的細胞作對照。

1.3各組細胞p70S6KmRNA的檢測分別提取轉(zhuǎn)染對照siRNA 48 h的EC9706細胞、轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706細胞及未轉(zhuǎn)染的EC9706細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測p70S6K mRNA。PCR反應體系25 μL，其中cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL。擴增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。反應結(jié)束后取p70S6K和GAPDH的PCR產(chǎn)物各10 μL進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗重復3次。以p70S6K與GAPDH條帶灰度值的比值表示p70S6K mRNA的相對表達量。

1.4各組細胞p70S6K蛋白的檢測分別收集轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706細胞，提取總蛋白，以未轉(zhuǎn)染的EC9706細胞為對照。蛋白上樣量均為30 μg。p70S6K及p-p70S6K一抗分別按1500和1600稀釋，二抗均按110 000稀釋。轉(zhuǎn)膜條件為：半干轉(zhuǎn)膜，12 mA，1 h。50 g/L脫脂奶粉PBST溶液室溫下振搖封閉2 h，加一抗后4 ℃過夜。次日PBST洗3次，5 min/次，然后加二抗室溫下振搖2 h，再用PBST洗3次，5 min/次，ECL發(fā)光液孵育2 min，曝光。實驗重復3次。以p70S6K或p-p70S6K與GAPDH條帶灰度值的比值表示p70S6K或p-p70S6K蛋白的相對表達量。

1.5各組細胞細胞存活率測定收集轉(zhuǎn)染24 h和未轉(zhuǎn)染的EC9706細胞，分別接種于96孔板，每個樣本設3個復孔，細胞貼壁后，加入不同濃度的雷帕霉素(0、25、50、100、150、250、500、1 500 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h；每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在自動酶標儀上測定波長490 nm處各孔吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組細胞p70S6K mRNA和蛋白表達的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，采用2×8析因設計的方差分析比較轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組細胞存活率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細胞轉(zhuǎn)染效率細胞轉(zhuǎn)染對照siRNA 48 h后，在熒光顯微鏡(×200)下可見明顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率可達95%以上，提示對照siRNA能順利轉(zhuǎn)染進入細胞，故認為同等條件下p70S6K-siRNA也能轉(zhuǎn)染進入細胞。

2.2p70S6K-siRNA對EC9706細胞p70S6KmRNA表達的影響見圖1。未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染對照siRNA組、轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24 h組和48 h組p70S6K mRNA的相對表達量分別為(2.00±0.28)、(1.40±0.17)、(0.64±0.09)和(0.32±0.06)，4組間差異具有統(tǒng)計學意義(F=57.825，P<0.01)；轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA的EC9706細胞中p70S6K mRNA表達較其他組下降，且轉(zhuǎn)染時間長者其表達更低(P<0.05)。

2.3p70S6K-siRNA對EC9706細胞p70S6K及p-p70S6K蛋白表達的影響與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA的EC9706細胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表達降低。見圖2、表1。

圖1 各組細胞中p70S6K mRNA的表達

圖2 各組細胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表達

表1 各組細胞中 p70S6K和p-p70S6K蛋白的表達比較 (n=3)

*：與未轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

2.4雷帕霉素對p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染的EC9706細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染后細胞對雷帕霉素的敏感性增加。見表2。

表2 雷帕霉素作用后各組EC9706細胞存活率的比較 (n=3) %

F組間=1 958.000，F(xiàn)劑量=664.919，F(xiàn)交互=55.184，P均<0.001。

3 討論

腫瘤的形成是一個多步驟、多因素影響的過程，發(fā)病的原因很多，癌基因的激活、信號通路的異常等都會導致腫瘤的發(fā)生，應用RNA干擾對腫瘤基因進行沉默抑制，從而為腫瘤的研究及治療尋找新的途徑已經(jīng)引起人們的廣泛關注。Matsubara等[8]觀察到利用siRNA干擾mTOR的表達后，非小細胞肺癌細胞增殖減慢，凋亡增加，細胞遷移受到抑制。Jin等[9]觀察到沉默Twist1基因，激活LKB1/AMPK/mTOR通路，下調(diào)mTOR/S6K1活性，降低Mcl-1蛋白的表達，可促進非小細胞肺癌細胞對順鉑的敏感性。張威等[10]干擾EC9706細胞中mTOR的表達，最終抑制了EC9706細胞的增殖并促進其凋亡。

食管鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)存的治療方法還不能對其進行很好的治療。已有報道[11-13]證實PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。mTOR通路在EC9706細胞中異常激活，mTOR抑制劑雷帕霉素在體內(nèi)外均可抑制食管鱗癌細胞的生長[14-15]。由于 mTOR分子較大(相對分子質(zhì)量為289 000)，與其作用的蛋白也較多，而p70S6K作為mTOR下游最重要的靶點之一，第389位蘇氨酸可直接被mTOR磷酸化，p-p70S6K可以促進延長因子-1a、poly(A)結(jié)合蛋白等蛋白的翻譯及表達[16]。因此，作者認為用siRNA下調(diào)p70S6K的表達，可導致細胞對雷帕霉素更加敏感。在檢測p70S6K-siRNA對p70S6K mRNA的干擾效果時，作者同時轉(zhuǎn)染對照siRNA，發(fā)現(xiàn)其對p70S6K無明顯干擾效果，因此在檢測其對p70S6K蛋白表達的影響時未設此對照。該實驗數(shù)據(jù)顯示，干擾后p70S6K mRNA的表達及其蛋白的磷酸化水平明顯減低，且雷帕霉素對細胞增殖的抑制作用更加明顯，說明干擾p70S6K表達后EC9706細胞對雷帕霉素敏感性增強。該研究可能為食管鱗癌的分子治療提供實驗依據(jù)。

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