江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析*

王璐，梁小剛，陸健

1(無錫中糧工程科技有限公司，江蘇無錫，214035)

2(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

我國啤酒產(chǎn)量已連續(xù)十多年位居世界之首，啤酒行業(yè)對(duì)啤酒生產(chǎn)原料的需求還會(huì)持續(xù)增加［1］。啤酒大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的主要原料之一，大麥中復(fù)雜的微生物群落(革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌，酵母和絲狀真菌)對(duì)麥芽制造及啤酒釀造有著非常重要的影響［2］。江蘇啤酒大麥在國產(chǎn)啤酒大麥中占有重要的位置，但其收獲季節(jié)頻遇雨季，容易受到各種微生物的侵染，致使麥芽品質(zhì)有不同程度的下降，甚至影響到啤酒的釀造［3］。真菌微生物能產(chǎn)生各類真菌毒素、啤酒酵母提前絮凝因子等［2，4］，國內(nèi)已經(jīng)關(guān)注啤酒大麥中的真菌群落結(jié)構(gòu)及其對(duì)麥芽品質(zhì)造成的影響［5－7］。由于江蘇地理環(huán)境與氣候等因素的影響，細(xì)菌在江蘇啤酒大麥中存在的種類與數(shù)量很多，對(duì)麥芽釀造品質(zhì)的影響(麥汁過濾速度緩慢、導(dǎo)致啤酒風(fēng)味改變等)也很突出［2，8－9］，因此，有必要詳細(xì)了解江蘇啤酒大麥制麥過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究其對(duì)麥芽釀造品質(zhì)的影響提供依據(jù)。

啤酒大麥微生物群落中細(xì)菌的數(shù)量最多，有研究稱一個(gè)單一的大麥麥粒上面附著著約50萬個(gè)細(xì)菌，如此多的細(xì)菌勢必會(huì)對(duì)制麥過程及麥芽品質(zhì)造成影響［10］。如想更加清楚地了解江蘇啤酒大麥制麥過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，需要選擇合理的檢測手段。而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法存在一些弊端，需針對(duì)不同細(xì)菌種類設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)基，且需要較長的培養(yǎng)時(shí)間，耗費(fèi)大量的人力物力等［11］。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方面已得到廣泛的應(yīng)用［5］，但國內(nèi)尚未有利用PCR－DGGE分析江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道。將傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法與PCR-DGGE技術(shù)相結(jié)合，會(huì)使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確、全面［12］。

本文利用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)江蘇目前的主要品種(單二)啤酒大麥制麥過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析，旨在了解江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步了解細(xì)菌對(duì)江蘇啤酒大麥麥芽品質(zhì)的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

江蘇單二啤酒大麥，在江蘇某麥芽企業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)場(塔式制麥)取樣，每個(gè)樣品都隨機(jī)取樣3次(即在3批次投料過程中分別取樣)。制麥工藝如下:錐底浸麥:浸麥水溫度14～15℃，濕浸6.5 h，干浸7.5 h;平底浸麥:水溫14～15℃，濕浸6.5 h，干浸7.5 h，浸麥度達(dá)到41% ～42%;發(fā)芽:溫度15～16℃，水分含量44% ～46%，時(shí)間85～90 h;排潮:溫度從57℃逐漸上升至65℃，時(shí)間15～16 h;焙焦:溫度從75℃逐漸升至83℃(85℃)，時(shí)間6～7 h，維持83℃(85℃)3 h。

1.1.2 主要試劑

Fast DNA○RSpin Kit For Soil，購自美國 MP Bio-medicals公司;去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素，均購自上海生工生物工程有限公司;Wizard○RGenomic DNA Purification Kit，購自 Promega;PCR所用試劑、DNA Marker、pMD18-T Vector試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit，均購自 TaKaRa公司;Gold view，賽百盛生物工程有限公司;SYBR GreenⅠ，北京優(yōu)尼康生物科技有限公司;其余試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，均為分析純。PCR擴(kuò)增所用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

DCodeTMUniversal Mutation Detection System、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng):BioRad公司，USA;Mastercycler nexus gradient梯度PCR儀:德國Eppendorf公司;FastPrep○R快速核酸提取儀(FP120)，美國 MPbio 公司;Gene Quant核酸蛋白定量儀GZNQVA，Biochrom，UK。

1.1.4 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，LB選擇性培養(yǎng)基，Nutrient Aagar(NA)培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基等配方，參照文獻(xiàn)［13］。

傳統(tǒng)新聞報(bào)道主要以專業(yè)、權(quán)威的報(bào)道敘述為主，為了適應(yīng)新媒體語境，各報(bào)業(yè)機(jī)構(gòu)開辦的官方微博、微信增強(qiáng)了親近性表達(dá)方式。例如，人民日?qǐng)?bào)海外版微信公眾號(hào)“俠客島”將“島叔”形象貫穿文本，通過將官媒人格化的方式拉近與用戶之間的距離。從報(bào)業(yè)機(jī)構(gòu)自身來看，其改變了以往高高在上的刻板印象，以更具人性化的形象擴(kuò)大自身的影響力。而從用戶角度來看，增強(qiáng)了其與媒體及其他用戶的互動(dòng)交流，也主動(dòng)掌握了在新聞事件中的話語權(quán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)

詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.2 啤酒大麥、麥芽總DNA的提取

稱取0.1 g粉碎后的樣品，用Fast DNA○RSpin Kit For Soil試劑盒進(jìn)行樣品總DNA提取，提取步驟參照說明書，得到的粗DNA進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增

研究中采用嵌套式PCR反應(yīng)對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，選用的引物參見表1。PCR反應(yīng)物(25 μL)中加有模板 DNA 0.5 μL，引物各 0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，rTaq酶2.5 U，Tris-HCl(pH 8.3)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，ddH2O補(bǔ)足至 25 μL。同時(shí)每一次實(shí)驗(yàn)都要用ddH2O代替模板DNA做陰性對(duì)照。第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后當(dāng)做第2輪PCR反應(yīng)中的模板DNA。反應(yīng)程序如下:27F-1492R:95℃ 5 min;95℃1 min，50 ℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;F341(GC)-R518:94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。各步的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4 DGGE分析

利用DCodeTMUniversal Mutation Detection System進(jìn)行DGGE分析。電泳條件:8%的聚丙烯酰胺凝膠;變性劑(100%的變性劑濃度為7 mol/L尿素，40%甲酰胺)梯度范圍為45% ～65%，電泳時(shí)間5.5 h;電泳溫度60℃;電壓150 V;電泳緩沖液為1×TAE buffer。上樣前在60℃，150 V的條件下預(yù)電泳30 min。電泳結(jié)束后用SYBR GreenⅠ染色45 min，分3次進(jìn)行，染色結(jié)束后用BioRad，Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，利用Quantity One軟件對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，計(jì)算生物多態(tài)性指數(shù)。DGGE條帶鑒定參照文獻(xiàn)［15］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用生物學(xué)軟件Quantity One(Quantity One 4.6.2，BioRad，USA)對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行處理分析，其中Phylogenetic Tree的聚類方法為UPGAMA。利用古生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件Palaeontology Statistics，(http://folk.uio.no/ohammer/past/)進(jìn)行生物多樣性指數(shù)的計(jì)算和PCA(Principal Component Analysis)分析。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的PCR引物Table 1 PCR Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 采用分離培養(yǎng)法對(duì)江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌群落進(jìn)行分析

對(duì)各種微生物的計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1，江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌數(shù)量有明顯的變化:錐底浸麥時(shí)細(xì)菌數(shù)量有明顯減少，平底浸麥和發(fā)芽階段的細(xì)菌數(shù)量迅速增加，到發(fā)芽結(jié)束時(shí)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大，而后隨著干燥的進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量不斷減少，但成品麥芽中的細(xì)菌數(shù)量比大麥還是有所增加。制麥過程的浸麥和發(fā)芽階段是各種微生物迅速增加的兩個(gè)主要階段，浸麥階段大麥的水分不斷增加，最終可達(dá)43% ～45%，非常適合細(xì)菌生長。而干燥階段的高溫會(huì)抑制微生物的生長甚至使部分菌群致死。利用一般常用的培養(yǎng)基對(duì)制麥過程大麥中的細(xì)菌進(jìn)行分離，只能得到一部分細(xì)菌，如果要更加全面地檢測出盡可能多的細(xì)菌種類，需要配制多種有針對(duì)性的培養(yǎng)基進(jìn)行分離，同時(shí)培養(yǎng)條件也要隨著菌種的不同而做調(diào)整［4］。

圖1 江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌數(shù)量的變化情況Fig.1 Changes of total count of bacteria in malting process of Jiangsu malting barley using culture methods

2.2 nested PCR－DGGE對(duì)江蘇啤酒大麥制麥過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行分析

將樣品粉碎后，用Fast DNA Spin Kit For Soil進(jìn)行總DNA的提取，以樣品總DNA為模板，按照1.2.3中的條件對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照1.2.4的條件進(jìn)行16S rDNA的DGGE分析，DGGE指紋圖譜見圖2。

圖2 制麥過程細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜(編號(hào)B～M如圖1所述)Fig.2 16S rRNA gene DGGE fingerprinting of bacteria communities using the primers GC－F341/R518

圖2表明，制麥過程不同樣品中細(xì)菌條帶有明顯變化，大麥從浸麥到發(fā)芽，細(xì)菌種類顯著增多，而干燥、焙焦后的成品麥芽中細(xì)菌種類又明顯減少。其中條帶15在制麥過程的各階段都存在，其在大麥中含量相當(dāng)豐富，最終麥芽中該細(xì)菌的量依然不少。

利用生物學(xué)軟件Quantity One對(duì)單二大麥制麥過程中細(xì)菌16S rDNA DGGE指紋圖譜(圖2)進(jìn)行分析，得到量化數(shù)據(jù)及聚類分析圖(見圖3)，利用PAST軟件進(jìn)行生物多樣性指數(shù)計(jì)算(表2)與PCA分析(圖4)。從圖3可以看出，啤酒大麥在儲(chǔ)藏、浸漬、發(fā)芽、焙焦等不同階段的細(xì)菌群落特征明顯不同，同階段樣品的細(xì)菌群落相似度較高，聚類結(jié)果非常接近，兩種引物的聚類結(jié)果略有不同。GC-F341/R518的聚類結(jié)果中樣品1、7和8分為一組，其余制麥中的樣品分為一組。

制麥過程中樣品細(xì)菌生物多樣性指數(shù)(表2)反映了大麥在制麥過程中細(xì)菌群落的豐富程度，從分析結(jié)果可知，大麥及成品麥芽的生物多樣性遠(yuǎn)不及浸麥和發(fā)芽階段的樣品，GC-F341/R518引物對(duì)中的發(fā)芽樣品(G2)的物種豐度最高，香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)也是最高，分別達(dá)到2.912和0.9409，但其細(xì)菌物種均勻性指數(shù)不是最高，為0.9198。

圖3 制麥過程樣品細(xì)菌16S rDNA nested PCR-DGGE的聚類分析(編號(hào)B～M如圖1所述)Fig.3 Cluster analysis of 16S rRNA gene DGGE fingerprinting of bacteria communities using the primers GC-F341/R518

圖4 細(xì)菌16S rDNA DGGE圖譜的PCA分析(編號(hào)B～M如圖1所述)Fig.4 PCA of the bacteria composition by PCR-DGGE analysis using primer sets GC-F341/R518

GC-F341/R518引物對(duì)的PCA分析(圖4)結(jié)果顯示，第一個(gè)主成分占44.48%，第二個(gè)主成分占29.68%。制麥過程中各樣品的分布相對(duì)分散，說明其中的細(xì)菌群落有明顯差異，主成分1最有可能受到樣品水分含量等的影響，主成分2主要受制麥工藝的影響。結(jié)果表明，制麥過程由于樣品水分含量、含氧量等條件的改變，細(xì)菌群落不斷發(fā)生著變化，排潮、焙焦結(jié)束后部分細(xì)菌被高溫環(huán)境抑制，細(xì)菌種類和數(shù)量急劇減少，但與大麥相比依然比較豐富，這與平板分離的結(jié)果一致。

表2 制麥過程樣品細(xì)菌16S rDNA Nested PCR-DGGE的生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity indices calculated from the DGGE banding patterns shown in Fig.2

表3是制麥過程中各樣品細(xì)菌16S rDNA DGGE條帶的核酸序列分析結(jié)果。經(jīng)分析，江蘇啤酒大麥制麥制麥過程中革蘭氏陰性細(xì)菌有不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)、腸桿菌屬(Enterobacter hormaechei)、歐文氏菌屬(Erwinia tasmaniensis)、黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyverasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)、法氏沃氏菌(Wautersiella falsenii)，革蘭氏陽性細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc lactis)、鏈球菌屬(Streptococcussp.)及多種未培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured bacterium)。其中最主要的革蘭氏陰性菌為泛菌屬和不動(dòng)桿菌屬，最主要的革蘭氏陽性菌為乳桿菌屬，革蘭氏陰性菌明顯多于革蘭氏陽性菌?？藚挝譅柺暇鷮僭谥汽溸^程中一直存在且數(shù)量較多，其為小的桿狀細(xì)胞，與腸桿菌屬的定義相符。細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠造成釀造過程過濾困難，而江蘇啤酒大麥制麥過程出現(xiàn)的腸桿菌屬、乳桿菌屬等細(xì)菌很多都會(huì)產(chǎn)生胞外多糖，這些細(xì)菌快速生長過程產(chǎn)生的胞外多糖可能降低了麥芽的過濾性能。此外，有研究表明泛菌屬、歐文氏菌屬等細(xì)菌會(huì)影響麥汁和啤酒的過濾，從而造成啤酒混濁問題［16］。浸麥階段，好氧細(xì)菌會(huì)與大麥競爭氧氣進(jìn)而抑制大麥的發(fā)芽。此外，大量細(xì)菌增值可能造成生物膜，同樣會(huì)對(duì)麥芽的過濾性能造成損害。

啤酒大麥中主要有歐文氏菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌、克呂沃菌屬和不動(dòng)桿菌屬。浸麥階段，樣品水分含量增加，許多其他細(xì)菌開始生長，如腸桿菌屬和泛菌屬細(xì)菌，浸麥也會(huì)洗掉部分細(xì)菌如Acinetobacter johnsonii。發(fā)芽階段樣品中的細(xì)菌數(shù)量達(dá)到峰值，細(xì)菌種類也是最豐富的。排潮結(jié)束樣品中細(xì)菌種類有所減少，如Pantoea agglomerans和Flavobacteriumsp.。焙焦后成品麥芽中細(xì)菌種類較之前有明顯減少，但數(shù)量仍多于大麥，乳桿菌屬、明串珠菌屬和鏈球菌屬等細(xì)菌均未被檢測到。此外，條帶16代表Streptococcus iniae只在浸麥后期樣品S2中檢測到，極有可能是浸麥水帶入。

圖5是制麥過程中細(xì)菌群落的系統(tǒng)進(jìn)化樹，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有很好的親緣分類，革蘭氏陽性菌中最主要的是乳酸菌，革蘭氏陰性菌種類較多。圖5中腸桿菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬與克呂沃爾氏菌屬細(xì)菌同屬于腸桿菌科，所以在進(jìn)化樹中親緣關(guān)系最近;乳桿菌屬、明串珠均屬與鏈球菌屬細(xì)菌親緣關(guān)系接近;法氏沃氏菌和黃桿菌屬細(xì)菌同屬于黃桿菌科，親緣關(guān)系接近。

表3 制麥過程樣品細(xì)菌16S rDNA nested PCR－DGGE條帶鑒定結(jié)果Table 3 Sequencing results of the bands cut from the DGGE gels of the bacteria community

3 結(jié)論與討論

江蘇啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌數(shù)量不斷發(fā)生著變化，浸麥初期細(xì)菌數(shù)量明顯減少，浸麥后期及整個(gè)發(fā)芽階段，細(xì)菌的數(shù)量都在不斷增加，發(fā)芽結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值;干燥階段細(xì)菌數(shù)量不斷減少，成品麥芽中的細(xì)菌數(shù)量與最初的大麥相比略有增加。所以，加強(qiáng)制麥過程中洗麥工作對(duì)減少細(xì)菌數(shù)量，降低細(xì)菌對(duì)麥芽品質(zhì)的影響至關(guān)重要。此外，成品麥芽的儲(chǔ)藏條件需要格外關(guān)注，一旦儲(chǔ)藏條件不合適，將會(huì)導(dǎo)致麥芽中微生物數(shù)量急劇增加，進(jìn)而降低麥芽質(zhì)量。

江蘇啤酒大麥制麥過程中主要的細(xì)菌有Acinetobacter，Enterobacter，Erwinia，F(xiàn)lavobacterium，Kluyvera，Lactobacillus，Lactococcus，Leuconostoc，Pantoea，Streptococcus，以及Wautersiella。其中Enterobacter，Erwinia和Pantoea是啤酒大麥中最常見的細(xì)菌。Laitila曾利用PCR-DGGE對(duì)啤酒大麥制麥過程中細(xì)菌進(jìn)行了分析，也鑒定出Enterobacter，Erwinia和Pantoea這3種細(xì)菌［11］。Streptococcus在啤酒大麥中并不常見，可能是環(huán)境中的細(xì)菌，因此制麥過程做好設(shè)備環(huán)境等衛(wèi)生工作也非常重要。

另外，還對(duì)比了制麥過程中單二大麥與加拿大Metcarlfe大麥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)單二大麥制麥過程中細(xì)菌數(shù)量明顯偏高，單胞菌細(xì)菌較少，這些差異對(duì)單二麥芽品質(zhì)有著潛在的影響。

通過比較傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法分離得到的微生物和DGGE分析得到的微生物的種類，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)分離得到的大部分微生物均會(huì)在DGGE分析中出現(xiàn)，但也有像Lysinibacillus fusiformis這樣的細(xì)菌并未在分子鑒定中出現(xiàn)，同時(shí)DGGE中檢測到的很多細(xì)菌種類并沒有在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)中獲得，這可能有以下原因:DGGE分析中需要得到樣品中微生物的基因組才能最終檢測到該種微生物，但實(shí)際操作中無法非常全面地將所有細(xì)菌的DNA提取得到，尤其是原本數(shù)量較少的細(xì)菌種類;傳統(tǒng)分離培養(yǎng)不僅耗時(shí)，而且單一的培養(yǎng)基無法適合所有細(xì)菌的生長，只能得到少數(shù)種類的細(xì)菌。傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法與DGGE分析相結(jié)合是比較合適的分析大麥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的。

圖5 制麥過程樣品細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic relationships of 16S rDNA sequences of the bacteria community

［1］ 陳明賢，張國平.全球大麥發(fā)展現(xiàn)狀及中國大麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展分析［J］.大麥與谷類科學(xué)，2010(4):1－4.

［2］ van Nierop S，Rautenbach M.The impact of microorganisms on barley and malt quality-A review［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists，2006，64(2):69－78.

［3］ 梁剛.啤酒大麥和麥芽微生物對(duì)啤酒質(zhì)量的影響［J］.釀酒科技，1999，91(1):56 －57.

［4］ Flannigan B.The microbiota of barley and malt.3rd Edition［M］.New York:Kluwer Academic/Plenum Publishers.2003:113 －180.

［5］ 梁小剛，蔡國林，陸健，等.利用nested PCR-DGGE技術(shù)分析江蘇啤酒大麥真菌群落結(jié)構(gòu)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(8):1 －6.

［6］ 梁小剛.江蘇啤酒大麥制麥過程中微生物的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2013.

［7］ 金昭.啤酒釀造過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的初步研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2009.

［8］ 慕鈺文.江蘇啤酒大麥麥芽中β–淀粉酶對(duì)過濾性能的影響［D］.無錫:江南大學(xué)，2013.

［9］ Pavel K，Krizek M.A review of biogenic amines and polyamines in beer［J］.Journal of the Institute of Brewing，2003，109(2):123 －128.

［10］ Laitila A.Microbes in the tailoring of barley malt properties［D］.Helsinki，F(xiàn)inland:University of Helsinki，2007.

［11］ Laitila A，Kotaviita E，Peltola P，et al.Indigenous microbial community of barley greatly influences grain germination and malt quality［J］ .Journal of the Institute of Brewing，2007，113(1):9 －20.

［12］ Tae-Woon Kim，Jun-Hwa Lee，Sung－Eon Kim，et al.A-nalysis of microbial communities indoenjang，a Korean fermented soybean paste，using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，131:265 －271.

［13］ 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，［M］.北京:高等教育出版社，2006.372－374.

［14］ 蘇紅旭，王璐，徐凱，等.制麥過程中微生物菌群的變化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(5):745－749.

［15］ 張中華.紹興黃酒麥曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2012.

［16］ Priest FG，Campbell I.Brewing microbiology.3rd Edition［M］.New York:Kluwer Academic/Plenum Publishers，2003:113 －132.