原核表達(dá)重組牛凝乳酶原及重組牛凝乳酶酶學(xué)特性*

普燕，李軼杰，張富春

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊，830046)

凝乳酶是制造干酪過程中起凝乳作用的關(guān)鍵性酶，對干酪的質(zhì)構(gòu)及干酪特有風(fēng)味的形成有非常重要的作用。它存在于未斷奶的哺乳動物胃中，能夠?qū)Ｒ恍粤呀猞?酪蛋白多肽鏈105～106位的苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵［1－3］，使得酪蛋白沉淀凝聚，乳清排出。凝乳酶的傳統(tǒng)來源是吃奶的小牛皺胃(第四胃)，可用來制作各種類型的干酪，也是衡量其他凝乳酶代用品的標(biāo)準(zhǔn)。隨著世界范圍內(nèi)干酪市場需求的日益增長，來源于小牛皺胃的凝乳酶制劑難以滿足干酪制作的需求量，人們開始尋找小牛凝乳酶替代品。凝乳酶按來源分為動物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶以及基因工程凝乳酶。但植物蛋白酶受到時間與地域限制，不能大規(guī)模獲得;微生物凝乳酶對蛋白質(zhì)分解能力比皺胃酶高，干酪得率低，成熟后味苦，耐熱性高，給乳清的利用帶來不便;其他動物來源的凝乳酶雖能替代部分小牛凝乳酶制作干酪，但也存在來源不穩(wěn)定，酶穩(wěn)定性差或凝乳活性低等問題。目前仍然認(rèn)為，小牛凝乳酶是最佳的干酪制作凝乳酶，因此基因工程成為解決凝乳酶制劑需求量的新途徑，目前已成功獲得牛［4－5］、水牛［6］、山羊［7］和單峰駝［8］等多種動物的基因工程重組凝乳酶。研究表明，基因工程凝乳酶與天然小牛皺胃酶幾乎完全相同，酶學(xué)特性沒有明顯差異［9］。此外，重組牛凝乳酶產(chǎn)品的純度高，含100%凝乳酶(小牛胃萃取液僅含70% ～90%凝乳酶)［10］，所制造的干酪在收率與品質(zhì)上也優(yōu)于小牛胃凝乳酶制造的干酪。

本研究結(jié)合乳酸菌和大腸桿菌密碼子的偏愛性合成了凝乳酶原基因，實現(xiàn)了凝乳酶原在大腸桿菌的高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)包涵體純化后，通過復(fù)性處理獲得大量較高純度的重組凝乳酶酶原，對其進(jìn)行酸化/中和處理，獲得具有活性的凝乳酶，并研究了凝乳酶的酶學(xué)特性，旨在為凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供高效表達(dá)的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)、表達(dá)載體pET30a、含有牛凝乳酶原序列的質(zhì)粒pGEX-4T-1-pCHY［11］為本實驗室保存;密碼子優(yōu)化的牛凝乳酶原序列由上海生工(上海)有限公司合成，序列如下:

GAATTCGCTGAAATCACTCGTATCCCACTTTACAAAGGTAAATCACTTCGTAAAGCTCTTAAAGAACACGGTTTGCTTGAAGACTTCCTTCAAAAACAGCAATACGGTATCTCATCAAAATACTCAGGTTTCGGTGAAGTTGCTTCAGTTCCACTTACTAACTACCTTGATTCACAATACTTCGGTAAAATCTACCTTGGTACTCCACCACAAGAATTTACTGTTCTTTTCGATACTGGTTCATCAGATTTCTGGGTTCCATCAATCTACTGTAAATCAAACGCTTGTAAAAACCACCAACGTTTCGATCCACGTAAATCATCAACTTTCCAAAACCTTGGTAAACCACTTTCAATCCACTACGGTACTGGTTCAATGCAAGGTATCCTTGGTTACGATACTGTTACTGTTTCAAACATCGTTGATATCCAACAAACAGTAGGTTTGAGCACTCAAGAACCAGGTGATGTTTTCACTTACGCT-GAATTTGATGGTATCCTTGGTATGGCTTACCCATCACTTGCTTCAGAATACTCAATCCCAGTTTTCGATAACATGATGAACCGTCACCTTGTTGCGCAGGACTTGTTCAGCGTCTACATGGACCGTAACGGTCAAGAATCAATGCTTACTCTTGGTGCTATCAACCCATCATACTACACTGGTTCACTTCACTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACAATACTGGCAATTCACTGTTGATTCAGTTACTATCTCAGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAAGGTGGTTGTCAAGCTATCCTTGATACTGGTACTTCAAAACTTGTTGGTCCATCATCAGATATCCTTAACATCCAACAAGCTATCGGTGCTACTCAAAACCAATACGGTGAATTTGATATCGATTGTGATAACCTTTCATACATGCCAACTGTTGTTTTCGAAATCAACGGTAAAATGTACCCACTTACTCCATCAGCTTACACTTCACAAGATCAAGGTTTCTGTACTTCAGGTTTCCAATCAGAAAACCACTCACAAAAATGGATCTTAGGTGATGTTTTCATCCGTGAATACTACTCAGTTTTCGATCGTGCTAACAACCTTGTTGGTCTTGCTAAAGCTATCCTCGAGTAATCTAGA

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

核酸限制性內(nèi)切酶和DNA Marker，大連寶生物工程有限公司;T4DNA連接酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司和大連寶生物工程有限公司;膠回收試劑盒，北京天根試劑公司;卡那霉素，上海生工有限公司;商品重組凝乳酶(CHY-MAX○Rpowder Extra NB)，丹麥科漢森公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將 pGEX-4T-1-pCHY［11］和 pET30a 質(zhì)粒分別用EcoR I和XhoI酶切后，將載體pET30a與基因片段prochymosin連接并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定后送上海生工公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-pCHY，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌E.coliBL21(pET30a-pCHY)。

1.2.2 重組凝乳酶原基因誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

挑取表達(dá)重組凝乳酶原的陽性菌落，接種于5 mL新鮮含有卡那霉素(50 mg/L)的LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1% 的接種量接至新鮮含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時:(1)加入終濃度為 0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體，用PBS洗滌后進(jìn)行全菌蛋白SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況，得出最優(yōu)的IPTG添加量;(2)加入終濃度為0.02 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo)表達(dá) 1、2、3、4、5、6、8、12 h，離心收集菌體，用 PBS洗滌后進(jìn)行全菌蛋白SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況，得出最優(yōu)的收獲菌體時間。

1.2.3 重組凝乳酶原大量表達(dá)與凝乳酶的初步純化

誘導(dǎo)表達(dá)1 L菌液，8 000 r/min離心1 min后除去培養(yǎng)基上清液，菌體沉淀用20 mL PBS洗滌3次，加18 mL細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)，2 mL 10%Triton X-100，苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1 mmol/L及添加溶菌酶至終濃度1 mg/mL，冰浴30 min，超聲至菌液不再黏稠。12 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀加20 mL細(xì)胞裂解液和2 mL 2%脫氧膽酸，冰浴30 min，期間不斷攪拌。12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌3次。加6 mol/L尿素溶解包涵體，12 000 r/min離心去除不溶雜質(zhì)，將溶液裝入透析袋中，放入約50倍體積的透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)中透析，每12 h換一次尿素含量從高向低逐級遞減的透析液，最后用不含尿素的透析液透析3次，12 000 r/min離心20 min，上清液分裝保存。

將獲得的重組凝乳酶原用1 mol/L HCl調(diào)pH到2.0，室溫放置2 h，再用1.5 mol/L Tris回調(diào) pH到6.0。此時出現(xiàn)大量絮狀沉淀，將此液于12 000 r/min離心10 min，上清液中只含有活化的凝乳酶與his標(biāo)簽融合的酶原N端釋放肽段，此即為初步純化的凝乳酶。商品重組凝乳酶作為對照，用蒸餾水按1∶20(w/v)配制后進(jìn)行相關(guān)測定。

1.2.4 重組凝乳酶活性測定

采用阮小華等［12］方法，略有修改。取 10 mL 10%的脫脂乳(用0.01 mol/L CaCl2配制)，在35℃下保溫5 min，加入0.5 mL初步純化的凝乳酶液，迅速混合均勻，直到在管壁上觀察到凝乳顆粒，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳液凝固的時間(s)，把40 min凝固1 mL 10%的脫脂乳定義為1個索氏單位(soxhlet unit)。

式中:t為乳液凝固時間，s;D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 凝乳酶作用最適溫度的測定

采用李玉秋等［13］方法。將酶反應(yīng)體系在20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70℃下檢測重組凝乳酶的活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度下凝乳酶的相對酶活力，商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

采用李玉秋等［13］的方法，略有改動。將酶液分裝于試管中，分別在 35、40、45、50、55 ℃水浴中溫育，每隔10 min取樣(55℃每隔2 min取樣)，迅速冰浴冷卻。在35℃下測定殘余重組凝乳酶的活力，將未處理酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 凝乳酶作用的最適pH值

采用阮小華等［12］的方法，略有改動。用濃度為2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH將10%脫脂乳的pH調(diào)到 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在 35℃ 水浴中溫育 5 min，進(jìn)行酶活力的測定，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同pH乳液中凝乳酶的相對酶活力。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.8 凝乳酶的pH穩(wěn)定性

采用阮小華等［12］的方法，略有改動。用濃度為0.2 mol/L的 HCl和0.2 mol/L的NaOH將酶液的pH 調(diào)到 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在冰上放置2 h，將酶液pH回調(diào)到6.0，測定酶活，比較未處理的酶活力計算相對酶活。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.9 金屬離子對酶活的影響

采用Jiang等［5］的方法，略有改動。將酶液中添加 NH4Cl、KCl、NaCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、ZnSO4、MgCl2、CuSO4、NiCl2的水溶液，使金屬離子終濃度達(dá)到10 mmol/L，4℃放置2 h測定酶活，比較未處理的酶活力計算相對酶活。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.10 蛋白酶抑制劑對酶活力的影響

采用姜媛媛等［14－15］方法，略有改動。將胃蛋白酶抑制劑pepstatin A和苯甲基磺酰氟(PMSF)配制成儲存濃度，按一定量加入酶液中混勻，放37℃下溫育1 h和24 h，同時做空白對照(不加任何蛋白酶抑制劑)。商品酶按1∶10(g∶mL)配制并進(jìn)行相同處理。在35℃下測定殘余酶活力。將空白對照酶液的酶活力定義為100%，分別計算不同處理條件酶液的相對活力。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pET30a-pCHY的構(gòu)建與重組牛凝乳酶原誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

表達(dá)載體pET30a-pCHY經(jīng)EcoR I和XhoI酶切鑒定，得到約1.1 kb的片段，與理論值大小相符，測序結(jié)果與合成序列完全一致，表明表達(dá)載體pET30apCHY構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。通過添加不同的IPTG濃度及在不同的誘導(dǎo)時間取樣，我們觀察到添加IPTG誘導(dǎo)后，在47 kDa左右出現(xiàn)與理論值相符的目的蛋白，即牛凝乳酶原，同時在37℃，220 r/min條件下，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件為:IPTG添加終濃度為0.02 mmol/L，誘導(dǎo)時間為4 h(見圖1)。

圖1 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the recombinant protein expression

2.2 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與初步純化

將轉(zhuǎn)化pET30a-pCHY重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)按1%接種1 L新鮮卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后全菌菌體分別留樣，其余培養(yǎng)物離心收集菌體，用PBS洗凈菌體沉淀后超聲裂解至菌液不再黏稠，對菌裂解上清液和菌裂解沉淀、包涵體懸液、尿素溶解包涵體及透析蛋白分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測。如圖2所示，目的蛋白為包涵體形式表達(dá)，用凝膠圖像分析軟件band-scan5.0分析，目的蛋白表達(dá)量占總菌蛋白的66.3%，包涵體的復(fù)性率達(dá)83.2%，通過計算，1 L新鮮的LB培養(yǎng)基可以最終獲得目的蛋白約200 mg。

圖2 重組蛋白表達(dá)檢測Fig.2 Detection of the recombinant protein expression

2.3 重組牛凝乳酶原活化及凝乳活性檢測

透析復(fù)性的重組蛋白經(jīng)過酸化/中和處理，取處理前和處理后樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。由圖3可以看出，與處理前的蛋白相比，經(jīng)酸化/中和處理后，47 kDa左右處的條帶消失，在37 kDa與10 kDa處出現(xiàn)了新的特征性條帶，其中37 kDa處條帶與理論成熟凝乳酶(36.5 kDa)大小相近，10 kDa與his標(biāo)簽融合凝乳酶原N端釋放肽段大小相符，表明初步純化出的凝乳酶原保留自剪切功能活性。

圖3 重組牛凝乳酶原的活化Fig.3 Activation of the recombinant bovine prochymosin

繼續(xù)進(jìn)行凝乳酶活性檢測，在10%脫脂乳(含0.01 mol/L CaCl2)中加入活化的重組凝乳酶，乳液凝固，而未加酶的對照脫脂乳不凝，說明重組凝乳酶有凝乳活性。將重組凝乳酶原和凝乳酶分別進(jìn)行凍干并復(fù)水，均保留原有活性，且計算得出凍干凝乳酶活力達(dá)到600 000 SU/g。從圖3中觀察到，酸化/中和處理后的凝乳酶液中含有較多的雜蛋白，經(jīng)過12 000 r/min離心10 min處理，可以得到僅含有凝乳酶和his標(biāo)簽融合凝乳酶原N端釋放肽段的酶液(第3泳道)，用該方法可初步純化凝乳酶，用于后續(xù)酶學(xué)特性實驗。

2.4 重組牛凝乳酶酶學(xué)特性分析

2.4.1 重組酶的最適作用溫度

從圖4可以看出，原核表達(dá)重組凝乳酶與商品凝乳酶反應(yīng)體系最適凝乳溫度在57～62℃，反應(yīng)體系高于65℃，凝乳活性迅速下降。

圖4 重組牛凝乳酶的最適作用溫度Fig.4 The optimum activity temperature of the recombinant chymosin

2.4.2 重組酶的最適作用pH值

從圖5可以看出，原核表達(dá)重組凝乳酶與商品凝乳酶均隨酶反應(yīng)體系pH值增高，凝乳活力下降。pH大于8時，凝乳活性完全喪失。

圖5 重組酶的最適作用pHFig.5 The optimum activity pH of the recombinant chymosin

2.4.3 重組酶的熱穩(wěn)定性

由圖6看出，原核表達(dá)重組凝乳酶與商品凝乳酶在35℃和40℃中放置1 h，酶活力保持良好，隨著溫度的增加，酶活力出現(xiàn)明顯的下降趨勢，商品凝乳酶較原核表達(dá)重組酶更為明顯。溫度達(dá)55℃時，兩者在短時間酶活喪失。

圖6 重組凝乳酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability of the recombinant chymosin

2.4.4 重組酶的pH穩(wěn)定性

如圖7所示，原核表達(dá)重組凝乳酶與商品重組凝乳酶在pH 2～7，酶活穩(wěn)定，保持在85%以上，當(dāng)pH值大于7時，酶迅速失活。

圖7 重組凝乳酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 The pH stability of the recombinant chymosin

2.4.5 金屬離子對酶活的影響

從圖8可以看出，Al3+、Fe3+和Cu2+對原核表達(dá)酶活力有增強(qiáng)作用，比較未處理組的酶活，相對酶活力達(dá)到150%、130%、128%;但這3種離子作用的商品酶活力分別為106%、78%、94%，即除了Al3+對商品酶活力作用為增強(qiáng)之外，F(xiàn)e3+和Cu2+對其酶活有抑制作用。其次Zn2+對二者的作用也不同，相對酶活分別為105%和93%。其他離子中，Ni2+對兩者酶活均有明顯抑制作用，NH4+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+對酶活作用不明顯。

圖8 金屬離子對酶活的影響Fig.8 The effect of metal ions on enzyme activity

2.4.6 酶活性抑制實驗

利用1 μmol/L和25 μmol/L的 pepstatin A 對酶活進(jìn)行抑制效果分析(圖9，圖10)。37℃處理1 h，原核表達(dá)重組凝乳酶活力下降10%和38%，商品凝乳酶活力下降15%和46%;37℃處理24 h，原核表達(dá)重組凝乳酶活力下降26%和53%，商品凝乳酶活力下降32%和44%。在對照實驗中，加入PMSF 1 000 μmol/L和5 000 μmol/L均沒有觀察到對酶活的抑制作用。

圖9 蛋白酶抑制劑對重組凝乳酶的活性抑制作用Fig.9 The inhibition effect of the protease inhibitor on recombinant chymosin activity

圖10 蛋白酶抑制劑對商品凝乳酶的活性抑制作用Fig.10 The inhibition effect of the protease inhibitor on commercial chymosin activity

3 討論

凝乳酶是制作酶凝干酪的關(guān)鍵性酶，凝乳酶品質(zhì)決定了干酪的出品率與質(zhì)地。傳統(tǒng)來源于小牛皺胃的凝乳酶制劑已經(jīng)不能滿足日益增長干酪制作的需求，需要尋找小牛凝乳酶的替代品。基因重組凝乳酶因其產(chǎn)量高、來源穩(wěn)定、品質(zhì)與天然凝乳酶相同、價格低廉而廣泛用于干酪制作。雖然已經(jīng)有許多國家用基因工程的方法生產(chǎn)重組凝乳酶并進(jìn)行干酪制作，但我國凝乳酶制劑主要依賴進(jìn)口，這對我國的干酪工業(yè)發(fā)展極為不利。

通過人工合成原核密碼子優(yōu)化的凝乳酶原基因，在大腸桿菌中獲得大量表達(dá)，凝乳酶原經(jīng)酸化/中和處理，凝乳酶活力達(dá)600 000 SU/g。但在酸化/中和處理時，當(dāng)pH值從2.0回調(diào)至6.0時，出現(xiàn)大量沉淀，這與張俊瑞［16］等報道的相同，可能原因是由于在體外復(fù)性過程中僅部分凝乳酶原能完成正確折疊進(jìn)而實現(xiàn)自我催化，而未正確折疊的重組蛋白則在酸化/中和的過程中以沉淀形式析出。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然能高效表達(dá)重組蛋白，但多以包涵體形式表達(dá)，需要溶解與復(fù)性過程，因而很多學(xué)者致力于提高包涵體的復(fù)性率研究。中國科學(xué)院微生物所的楊開宇［17］等人，在其發(fā)明專利中采用優(yōu)化的溶解包涵體及再折疊的工藝，可使復(fù)性率達(dá)到50%左右。唐兵［18］對蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)與GSH/GSSG促進(jìn)重組凝乳酶原復(fù)性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二硫鍵的錯誤配對是影響凝乳酶原多肽鏈正確折疊的主要原因。以上兩種提高包涵體復(fù)性率的方法中均使用了GSH/GSSG，本研究在包涵體復(fù)性過程中運用逐步降低尿素含量的透析方法，讓酶原在緩慢去除尿素的過程中復(fù)性，依然得到大量高活性的凝乳酶，為后續(xù)凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條低成本的純化選擇。

本研究表達(dá)的重組凝乳酶最適作用溫度為57～62℃，在pH 2～7、35～40℃范圍內(nèi)均比較穩(wěn)定，酶學(xué)特性與商品酶完全相同。金屬離子Al3+和Fe3+對酶活有增強(qiáng)作用，與Jiang等［5］人研究結(jié)果一致，但是關(guān)于Cu2+對酶活的作用效果截然相反。本研究表明Cu2+能夠增強(qiáng)酶活，而在Jiang等人結(jié)果中，Cu2+對酶活是抑制作用，同時本研究中Cu2+對商品凝乳酶作用后也表現(xiàn)出酶活力的輕微下降。由于離子對酶的影響比較復(fù)雜，差異可能與處理條件、離子濃度與蛋白濃度的比例、表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)的重組凝乳酶修飾差別有關(guān)，具體原因需進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)行酶學(xué)特性實驗的酶液中混合有his標(biāo)簽融合的酶原釋放肽段，該肽段的存在是否影響了酶活力及金屬離子對酶活的作用也有待進(jìn)一步探討。抑制劑對原核表達(dá)的重組酶影響實驗中，pepstatin A對酶活具有明顯的抑制效果，37℃處理1 h為10%和40%;處理24 h為20%和50%。但抑制效果低于姜媛媛等［14－15］人的結(jié)果，推測原因可能是重組凝乳酶的濃度過高，抑制效果不佳。本研究用PMSF作為抑制劑，發(fā)現(xiàn)加入PMSF的酶活力比空白對照酶活力還高，可能是因為PMSF抑制了酶液中其它微量的酶，而這些酶可能對于凝乳酶活性有一定影響?？傊吮磉_(dá)的重組凝乳酶在溫度和pH方面的酶學(xué)特性與商品重組凝乳酶相似，同時表達(dá)獲得的重組凝乳酶從酶活力和濃度方面有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，可為我國實現(xiàn)凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良的潛在菌種。

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