正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化絲綢水解條件

劉 娟，楊 柳，徐方圓，施超歐，吳珊珊，鄭 翠

(1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237;2.上海博物館館藏文物保存環(huán)境國家文物局重點(diǎn)科研基地，上海200050)

中國是絲綢文化的起源地［1］，絲織品自古以來就備受人們的青睞，絲綢文化是中華文化不可分割的一部分［2］。絲綢品種繁多，色彩絢麗受到歷代達(dá)官貴人的鐘愛，在歷代的陪葬品中絲織品幾乎隨處可見。在各地的考古工作中不斷有絲綢文物出土的消息，包括近年來湖州錢山漾出土的三千多年前的絲帶［3］、南京長干寺出土的宋代絲織品［4］、新疆尼雅遺址出土的漢綺［5］等。除了大量的出土絲織品外，各類博物館還收藏了大量春秋至清代的傳世品和已出土的絲織品、服飾等。由于絲綢的特殊性，這些珍貴的文物保護(hù)尤其迫切。

大量的絲織文物吸引了眾多學(xué)者對絲綢進(jìn)行了保護(hù)、人工老化、檢測方法等方面的研究。常用的檢測方法包括掃描電子顯微鏡［6］、色差法［7］、氨基酸檢測法［8］等，其中氨基酸檢測法由于其準(zhǔn)確性成為一種可靠的絲織品成分分析方法。目前氨基酸的分析方法有柱前衍生高效液相色譜法［9-11］、柱后衍生高效陽離子交換液相色譜法［12-14］等。由于大多氨基酸本身并不能吸收紫外可見光，需要對其進(jìn)行衍生，生成具有紫外可見吸收或者熒光響應(yīng)的衍生物才能進(jìn)行分析測定。本試驗(yàn)采用柱前鄰苯二甲醛(OPA)與芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)聯(lián)用在線自動(dòng)衍生(參考安捷倫公司氨基酸標(biāo)準(zhǔn)分析方法)，方法簡便、可在線完成衍生操作，不需要特定氨基酸分析儀，普通液相色譜也能完成分析，使用熒光檢測選擇性強(qiáng)，基體干擾小，方法重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

目前大多數(shù)的氨基酸分析法均采用相同的酸水解條件，即用6 mol/L鹽酸，110℃恒溫水解22 h［13］。這種方法在多個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)中作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白水解條件，例如 GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》、GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》及谷物籽粒氨基酸測定的前處理方法。這種水解條件適合大多數(shù)蛋白質(zhì)水解，但不具備針對性。針對絲綢的特點(diǎn)，其氨基酸的結(jié)構(gòu)不同于普通的蛋白質(zhì)，絲蛋白結(jié)晶度為50%～60%，以不溶于水的β折疊結(jié)構(gòu)為主，非晶區(qū)則是更為松散的結(jié)構(gòu)［14］。過于劇烈的水解條件容易破壞易降解的氨基酸，而不充足的水解條件又不能使蛋白質(zhì)盡可能水解為氨基酸，兩者均會(huì)造成檢測結(jié)果偏低。針對絲織品的特點(diǎn)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行絲織品水解條件的優(yōu)化，從而得出最適合絲綢的水解條件，為準(zhǔn)確檢測分析絲綢中氨基酸含量創(chuàng)造條件。

1 試驗(yàn)

1.1 材料與儀器

材料:絲綢坯布(市售 11218電力紡，經(jīng)密595根/10 cm，緯密420根/10 cm，白色)，鹽酸(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，苯酚(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，超純水(18.2 MΩ·cm，自制)，磷酸二氫鉀(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，磷酸氫二鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜純，HoneyWell公司)，甲醇(色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，鄰苯二甲醛(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，芴甲氧羰酰氯(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，3-巰基丙酸(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(安捷倫科技有限公司)，硼酸鹽緩沖液(安捷倫科技有限公司)，10 mL頂空瓶(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，頂蓋鉗，頂空鉗，高純氮。

儀器:Infinity1260型高效液相色譜配有DAD和FLD檢測器(安捷倫科技有限公司)，Reacti-Therm干式氮吹儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.2 正交設(shè)計(jì)

將影響水解結(jié)果的3個(gè)重要因素按3水平4因素的正交表排布，得到水解試驗(yàn)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表。

表1 水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental design for Hydrolysis____

按表1中試驗(yàn)條件，以隨機(jī)順序完成以上9組試驗(yàn)，另外，按照6 mol/L鹽酸，110℃恒溫水解22 h的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行一組試驗(yàn)作對比。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值即為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 溶液配制

水解液配制:將優(yōu)級(jí)純鹽酸稀釋成2、4、6 mol/L鹽酸溶液，水解時(shí)按每10 mL鹽酸加入5滴熱苯酚的比例配制成相應(yīng)濃度的水解液。

鄰苯二甲醛(OPA)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取50 mg OPA，加500μL甲醇溶解，再加入75μL的3-巰基丙酸，用硼酸緩沖液定容至5 mL，搖勻。

芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取 12.5 mg FMOC-Cl，用乙腈定容到 5 mL，搖勻。

1.4 絲綢樣品制備

根據(jù)GB/T 5009 124—2003《食品中氨基酸的測定》中的要求，水解蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)與水解液的比例應(yīng)為2︰3～2︰1(單位為mg/mL)。本試驗(yàn)水解液體積應(yīng)該在5～15 mL之間?？紤]到絲綢中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較脆弱，容易水解，故水解液體積估取6 mL。稱取(10.0±1.0)mg絲綢，放入10 mL潔凈的頂空瓶內(nèi)，加入6 mL水解液，用瓶蓋鉗鉗緊。蓋上鍍聚四氟乙烯的墊片和鋁蓋，用壓蓋鉗將頂空瓶鉗緊。

將裝好樣品和水解液的頂空瓶放入干式氮吹儀加熱模塊中，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表試驗(yàn)條件設(shè)定溫度，并在規(guī)定時(shí)間取出樣品。

將水解好的樣品轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，進(jìn)樣。

1.5 色譜條件

分析柱:ZORBAX Eclipse AAA分析柱 4.6×150 mm，粒徑 3.5μm。保護(hù)柱:ZORBAX Eclipse AAA保護(hù)柱4.6×12.5 mm，粒徑5μm。流動(dòng)相:A路為40 mmol/L、pH=7.8的磷酸緩沖鹽，B 路為45︰45︰10的甲醇乙腈水混合溶液。0～1.9 min，100%A路;1.9 ～18.1 min，A 路比例降為 57%;18.1 ～18.6 min，A 路比例降到零;18.6 ～ 22.3 min，A 路比例為0;22.3 ～23.2 min，A 路比例上升到100%;23.2～26 min，A路比例為100%。

檢測波長:DAD檢測器，波長238 nm;熒光檢測器，激發(fā)波長340 nm，發(fā)生波長450 nm。

衍生:采用OPA與FMOC-Cl聯(lián)用在線自動(dòng)衍生(參考安捷倫公司氨基酸標(biāo)準(zhǔn)分析方法)。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交結(jié)果

通過對各氨基酸結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，可得到水解結(jié)果(表2)。

表2 水解試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of hydrolysis experiment

2.2 正交結(jié)果分析

由于酸水解后胱氨酸、甲硫氨酸降解嚴(yán)重，因此不對這兩種氨基酸做結(jié)果討論。方差分析中涉及的顯著性水平α，指的是對作出的判斷大概有1－α的把握?？稍贔分布臨界值表中查出Fα(F溫度/濃度/時(shí)間，F(xiàn)誤差)。當(dāng) α =0.10，F(xiàn) 溫度/濃度/時(shí)間 ＞ Fα，說明有90%以上把握認(rèn)為因素對結(jié)果影響顯著，以“*”表示;α =0.05，F(xiàn) 溫度/濃度/時(shí)間 ＞ Fα，說明有 95%以上把握認(rèn)為因素對結(jié)果影響顯著，以“＊＊”表示;α=0.01，F(xiàn) 溫度/濃度/時(shí)間 ＞ Fα，說明有 99%以上把握認(rèn)為因素對結(jié)果影響顯著，以“＊＊＊”表示。以“*”表示某因素對結(jié)果影響的顯著性，下劃線表示該因素是最重要的影響因素。具體結(jié)果見表3。

表3 氨基酸正交結(jié)果分析Tab.3 Analysis of orthogonal results of amino acid

由表3可知，對水解效率影響最大的因素主要是水解液濃度，其次是水解溫度，這兩者的影響都比較大，而水解時(shí)間也有一定的影響，不過較前兩者影響要小得多。而水解液濃度有兩種選擇:4 mol/L和2 mol/L。水解溫度則是105℃更為合適。水解時(shí)間也有兩種選擇:15 h和18 h。這也就意味著最優(yōu)水解條件現(xiàn)在可能有4種組合。其中4 mol/L鹽酸水解液，105℃恒溫水解15 h正是試驗(yàn)4的條件，但2 mol/L鹽酸水解液，105℃恒溫水解15 h、18 h及4 mol/L鹽酸水解液，105℃恒溫水解18 h并未在試驗(yàn)表中，所以需要對這3個(gè)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確定水解的最優(yōu)條件。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

按上述總結(jié)的3個(gè)試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2 mol/L鹽酸，105℃恒溫水解15 h、18 h后，絲綢樣品并未水解完全，可以清楚地看到有部分絲綢殘片懸浮在水解液中，因此2 mol/L鹽酸水解液的條件不可行。以下就以4 mol/L鹽酸水解液，105℃恒溫水解18 h的水解條件為驗(yàn)證試驗(yàn)的條件進(jìn)行分析對比。

由表4數(shù)據(jù)可知，試驗(yàn)4條件下，各氨基酸水解率均為最大值或者接近最大值，是最適合絲綢水解的條件。故4 mol/L鹽酸水解液，105℃恒溫水解15 h為最優(yōu)條件。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)表對比Tab.4 Comparison of verification test result and orthogonal test table

2.4 最優(yōu)水解條件色譜圖

熒光及紫外線色譜見圖1、圖2。

圖1 試驗(yàn)4熒光檢測色譜圖Fig.1 Fluorescence detection chromatogram of fourth experiment

圖2 試驗(yàn)4紫外線檢測色譜圖Fig.2 UV detection chromatogram of fourth experiment

圖1中由于18 min后會(huì)有很高的衍生試劑響應(yīng)信號(hào)，對比之下氨基酸峰則會(huì)小到忽略不計(jì)，故時(shí)間窗展示范圍改為氨基酸出峰時(shí)間0～18 min。

2.5 最優(yōu)條件與標(biāo)準(zhǔn)條件對比

表5 標(biāo)準(zhǔn)條件與最優(yōu)條件結(jié)果對比Tab.5 Comparison of results under standard condition and optimal condition

用4號(hào)試驗(yàn)結(jié)果減去常用條件結(jié)果，再將這個(gè)差值比上標(biāo)準(zhǔn)條件結(jié)果，即為含量提高的百分比。由于含量較低的氨基酸容易受處理過程的影響，容易造成較大誤差，表5中顯示的是含量超過0.5 g/100 g的氨基酸變化情況。

3 結(jié)論

1)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對水解結(jié)果影響最大的3個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，由正交試驗(yàn)結(jié)果可知:在最優(yōu)水解條件下，盡可能提高了各氨基酸的含量，能真實(shí)反映出待測絲織品中的真實(shí)氨基酸含量，特別是低含量的氨基酸。在試驗(yàn)4的水解條件下含量超過0.5 g/100 g的氨基酸中，除異亮氨酸外，各氨基酸含量明顯高于標(biāo)準(zhǔn)條件水解后的氨基酸含量，增幅在5.88% ～73.13%，而總氨基酸的含量增幅更是達(dá)到了 13.68%。

2)與優(yōu)化水解方法對比，結(jié)果表明常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)水解條件不適合絲綢樣品的水解，減少水解強(qiáng)度可有效降低氨基酸的降解。尤其某些活潑氨基酸，如酪氨酸、絲氨酸更容易在劇烈的水解條件下降解，而這些氨基酸往往是判斷絲織品老化程度的關(guān)鍵。因此，優(yōu)化絲綢水解條件是保證絲織品氨基酸研究結(jié)果正確的關(guān)鍵步驟和前提條件之一。

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