銀木和樟樹遺傳多樣性與親緣關(guān)系的RAPD分析

柯艷妮,田良濤,陳永勤,王樸,楊之帆,陳桂橋

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430062;2.武漢市園林科學(xué)研究所,湖北 武漢 430081)

0 引言

樟樹又名芳樟,為樟科樟屬常綠闊葉喬木,是我國南方廣為栽種的重要觀賞園林樹種,常用作行道樹,在夏季有很好的遮蔭、降溫作用[1].同時,它也是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹種,是提取樟腦、芳樟醇、黃樟油素、桉葉油素、松油醇等精油的主要原料[2-3].

銀木也為樟科樟屬常綠闊葉喬木[1],與樟樹形態(tài)非常相似,但葉片比樟葉大,故又名大葉樟.銀木生長速度較快,成年樹高可達(dá)25 m,胸徑1.5 m,冠大蔭濃,樹姿雄偉,且葉片正面為綠色,背面為銀白色,風(fēng)吹葉動時樹冠綠白閃爍,景色優(yōu)美,具有很好的觀賞性和園林利用價值.但銀木在園林上的應(yīng)用遠(yuǎn)不如樟樹普遍,主要原因是擔(dān)心其耐低溫性能不強(qiáng).30年前武漢市園林科學(xué)研究所從四川引種了少量銀木,長期觀察發(fā)現(xiàn),銀木在武漢市生長良好,且沒有樟樹容易出現(xiàn)葉片黃化的現(xiàn)象,經(jīng)受了幾個較強(qiáng)低溫冬季的考驗.特別是在2008年初百年一遇的低溫暴雪天氣(20天日平均溫度在0 ℃以下,最低溫度接近零下10 ℃)期間,銀木表現(xiàn)出比樟樹更強(qiáng)的抗寒性[4],說明銀木在長江中下游地區(qū)生長是安全的,具有良好的應(yīng)用前景[5].

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)技術(shù)是用短的寡核苷酸隨機(jī)序列作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)、擴(kuò)增獲得長度不同的多態(tài)性DNA片段,這些多態(tài)性DNA片段可以靈敏地反映不同個體之間的遺傳差異.樟樹作為我國重要的芳香油生產(chǎn)樹種和園林綠化樹種,人們對其進(jìn)行了遺傳多樣性研究[6-9].本研究用RAPD技術(shù)分析并比較了銀木和樟樹這兩種重要樟科植物間的遺傳多樣性與親緣關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 銀木(Cinnamomumseptentrionale)植株(7株,S1～S7)為武漢市園林科學(xué)研究所從四川引種,栽種于武漢市園林科學(xué)研究所;樟樹(Cinnamomumcaphora)為生長于湖北大學(xué)校園內(nèi)的芳樟,隨機(jī)選擇7株(C1～C7).

1.1.2 設(shè)備與試劑 DNA擴(kuò)增儀為德國Whatman Biometra公司生產(chǎn)的Tpersonal PCR儀.用于RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的50個隨機(jī)引物購自北京奧科生物技術(shù)責(zé)任有限公司,每個引物長度為10 bp.用于PCR反應(yīng)的Taq酶和其他試劑購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa).

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取銀木和樟樹幼嫩枝條,裝于塑料袋中帶回實驗室.取大約1 g幼嫩葉片,液氮冷凍、迅速研磨成粉末,并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中,用改良的CTAB法[10]提取基因組DNA.

1.2.2 RAPD-PCR及電泳 反應(yīng)體系為20 μL,含有1×buffer、DNA模板30 ng、2.0 mmol/L MgCl2、0.2 μmol/L引物、150 μmol/L dNTP和1.0 U Taq酶.

擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性5 min,然后40個循環(huán)(94 ℃變性30 s,37 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃下保存.

擴(kuò)增結(jié)束后,PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察譜帶,并照相保存.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析 每個反應(yīng)重復(fù)2～3次.根據(jù)凝膠統(tǒng)計擴(kuò)增的條帶數(shù),每個條帶看作一個遺傳位點,在相同遷移位置有帶記為1,無帶記為0.用Nei-Li相似系數(shù)法[11]計算出供試材料間遺傳相似性系數(shù),通過NTsys軟件用UPGMA法對其進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建聚類樹狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1引物的篩選與多態(tài)性分析以3份銀木和3份樟樹的基因組DNA為模板,按設(shè)定的反應(yīng)條件和程序用50個引物分別對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)凝膠電泳的結(jié)果,從中選出12個引物對所有的樣品進(jìn)行擴(kuò)增.入選引物的條件為:空白對照擴(kuò)增無帶,樣品有帶,且條帶清晰、不彌散.

用12個引物對7個銀木和7個樟樹樣品進(jìn)行擴(kuò)增,共得91條帶,其中多態(tài)性條帶為48條,多態(tài)性條帶百分率為52.7%;每個引物檢測到的條帶數(shù)介于4～11條之間,擴(kuò)增片斷長度大約在350～2 300 bp之間(表1).圖1為引物編號為S187對供試材料擴(kuò)增的電泳圖.

表1 用于銀木與樟樹RAPD分析的隨機(jī)引物及其擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物編號為S187對銀木和樟樹RAPD-PCR擴(kuò)增的結(jié)果S1～S7:銀木植株;C1～C7:樟樹植株;M:DS 5 000 marker

2.2銀木與樟樹的遺傳相似性分析遺傳相似系數(shù)的大小反映了物種間或物種內(nèi)個體間遺傳差異的大小和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.對RAPD擴(kuò)增結(jié)果利用Nei-Li方法計算得到銀木和樟樹種內(nèi)及種間的遺傳相似系數(shù),結(jié)果總結(jié)于表2.從表2可知,銀木植株間的遺傳相似系數(shù)最低為0.457、最高為0.781,平均為0.564;而樟樹植株間相應(yīng)的遺傳相似系數(shù)比銀木的高,其最低值為0.646、最高值為0.862,平均為0.777,這說明銀木個體間的遺傳差異比樟樹個體間的遺傳差異要大.

銀木植株與樟樹植株之間的遺傳相似系數(shù)在0.318～0.531之間,平均為0.422,明顯低于這兩種植物個體間相應(yīng)的遺傳相似系數(shù)(表2),說明銀木和樟樹有一定的遺傳相似性,但彼此間的親緣關(guān)系小于同種植物個體間的親緣關(guān)系.

表2 銀木與樟樹的遺傳相似系數(shù)比較

2.3銀木與樟樹親緣關(guān)系的聚類分析聚類分析結(jié)果(圖2)顯示, 在距離系數(shù)0.215處,銀木和樟樹各聚為一類,說明兩者之間存在較大的遺傳差異.隨著距離系數(shù)的縮小,兩種植物的不同植株被進(jìn)一步分成小類.與樟樹相比,銀木植株產(chǎn)生相同等級分類的距離系數(shù)要比樟樹大(圖2),這也說明了銀木植株間的遺傳差異比樟樹植株間的遺傳差異要大.

3 討論

RAPD技術(shù)是利用短的隨機(jī)引物檢測生物種群中同源序列的一種分子標(biāo)記技術(shù),具有簡便、快速和靈敏度高等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于植物種群劃分、種群或個體間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等研究領(lǐng)域[12].由于RAPD靈敏度高,使用合適的引物對于獲得正確結(jié)果非常重要.在本研究中,根據(jù)RAPD結(jié)果計算得到的遺傳相似系數(shù)(表2)顯示了銀木與樟樹之間存在一定的遺傳相似性,但兩種植物間的遺傳相似性低于同種植物個體間的遺傳相似性;根據(jù)RAPD結(jié)果進(jìn)行的聚類分析正確地把銀木植株和樟樹植株分成了兩大類(圖2),說明銀木植株與樟樹植株存在較大的遺傳差異.這些在DNA水平得到的結(jié)果符合傳統(tǒng)植物分類學(xué)的一般規(guī)律,說明所篩選出的12條隨機(jī)引物適合于樟樹與銀木的RAPD分析.

圖2 銀木和樟樹的聚類分析圖S1～S7:銀木植株;C1～C7:樟樹植株

宋愛云等[7]、張國防等[8]和邢建宏等[9]用RAPD技術(shù)分析了生長于福建的芳樟、腦樟、桉樟和黃樟等不同化學(xué)類型樟樹的遺傳差異,均發(fā)現(xiàn)同類型樟樹個體之間的遺傳相似性比較高,遺傳相似系數(shù)在0.5～1.0之間.張國防等[8]測得芳樟植株間的遺傳相似系數(shù)在0.525～1.000之間,邢建宏等[9]的結(jié)果為0.601～0.854.本研究分析了生長于武漢的芳樟植株間的遺傳差異,發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性也比較高,遺傳相似系數(shù)在0.646～0.862之間,與已有的結(jié)果相吻合.

在本研究中,遺傳相似性和聚類分析的結(jié)果都顯示了銀木植株間的遺傳差異大于樟樹植株間的遺傳差異.這很可能是由于樟樹人工栽培歷史悠久,在長期的育種、繁殖與栽培過程中,其遺傳物質(zhì)交流比較頻繁,因而個體間的遺傳多樣性變小;而銀木尚未大規(guī)模栽培,大都為自然植株,故植株間的遺傳多樣性仍然比較大.

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