6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠小腸集合淋巴結(jié)細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響

王雪芹，郝選明

（1.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.臨沂大學(xué) 體育學(xué)院，山東 臨沂 276005）

小腸集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches，PP結(jié))是免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和活化部位，其淋巴細(xì)胞最終離開(kāi) PP結(jié)歸巢到腸黏膜固有層，進(jìn)一步分化為成熟漿細(xì)胞并分泌IgA發(fā)揮免疫效應(yīng)[1]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡增加[2]。而長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo) PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究甚少，為了進(jìn)一步證實(shí)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo) PP結(jié)淋巴細(xì)胞的凋亡及機(jī)制，本研究著重探討遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，PP結(jié)淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的變化、細(xì)胞凋亡關(guān)鍵分子細(xì)胞色素C(Cytochrome C，簡(jiǎn)稱Cyt C)的變化及與線粒體凋亡通路密切相關(guān)的促凋亡基因 BaxmRNA和抗凋亡基因 Bcl-2mRNA的表達(dá)情況，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中 PP結(jié)淋巴細(xì)胞的線粒體凋亡機(jī)制，為長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠(8周齡，64只，購(gòu)自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK (粵)2008-0020；NO:0104976，粵監(jiān)證字 F2008A002)被隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各為32只。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練，對(duì)照組，正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，于第0、2、4、6周末各從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組取8只大鼠臟器并測(cè)試相關(guān)指標(biāo)(最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h無(wú)菌采樣)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

采用本課題組反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索的 6周遞增負(fù)荷模型。先采用低強(qiáng)度適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)(10 m/min)訓(xùn)練1周后，負(fù)荷遞增至 20 m/min。隨后每周遞增負(fù)荷增量 5 m/min。至第6周，達(dá)到40 m/min。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

1)線粒體膜電位測(cè)定：JC-1膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所(C2006)，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌條件下，從小腸壁上切取PP結(jié)，取200目鋼網(wǎng)極輕柔研磨細(xì)胞，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。收集的細(xì)胞用冷PBS離心(200 g，5 min)洗滌2次，懸浮于含100 mL/L胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并且調(diào)整細(xì)胞濃度，取5×105細(xì)胞，重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0. 5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后，離心3 min(600 g ，4 ℃)，沉淀細(xì)胞。棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2次后，再用1 mL的JC-1染色緩沖液重懸，并立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)采用 WinMDI 2.9軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)紅色熒光強(qiáng)度平均值和綠色熒光強(qiáng)用紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值代表線粒體膜電位去極化程度。

2)Bax、Bcl-2mRNA的測(cè)定：RNAiso Plus和SYBR?Premix Ex TaqTM反應(yīng)試劑購(gòu)自(TaKaRa)大連寶生物公司；引物(見(jiàn)表1)委托上海Invitrogen公司合成；采用全自動(dòng)熒光定量PCR儀進(jìn)行測(cè)定。

表1 Bax基因、Bcl-2基因和GAPDH管家基因引物序列

3)細(xì)胞色素C的測(cè)定：采用ELISA檢測(cè)，Cyt C濃度測(cè)定嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒(R＆D systems)說(shuō)明書要求進(jìn)行。在酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F200)上，于450 nm波長(zhǎng)讀取光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Cyt C的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 對(duì)照組測(cè)試指標(biāo)的變化

第0、2、4、6周，對(duì)照組的PP結(jié)線粒體膜電位、PP結(jié)淋巴細(xì)胞Bax、Bcl-2mRNA和Cyt-C濃度差異沒(méi)有顯著性(P<0.05)，表明6周生長(zhǎng)對(duì)這些指標(biāo)沒(méi)有影響。

2.2 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)PP結(jié)線粒體膜電位的影響

線粒體對(duì)JC-1的攝取依賴于跨膜電位，正常PP結(jié)淋巴細(xì)胞線粒體的膜電位高，細(xì)胞受損后，線粒體膜電位下降。在JC-1染色中，受到ΔΨm和制約，因此，很多研究數(shù)值來(lái)反映ΔΨm[4]。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，4周顯高于0周，差異具有顯著性(P<0.05)。0周到4周PP結(jié)淋巴細(xì)胞ΔΨm持續(xù)下降，6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞ΔΨm略有上升。2、6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞ΔΨm與0周相比，差異具有顯著性(P<0.05)；4周PP結(jié)淋巴細(xì)胞ΔΨm與0周相比，差異具有非常顯著性(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中PP結(jié)ΔΨm的變化

2.3 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì) PP結(jié)淋巴細(xì)胞 Bax和Bcl-2mRNA的影響

結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，與0周相比，2、4、6周BaxmRNA表達(dá)升高，其中4和6周的BaxmRNA表達(dá)明顯高于0周，差異具有顯著性(P<0.05)；與0周相比，4、6周Bcl-2mRNA表達(dá)降低，其中4和6周Bcl-2mRNA表達(dá)明顯低于 0周，差異具有非常顯著性(P<0.01)；4周與2周相比，Bcl-2mRNA表達(dá)明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)；與0周相比，2、4、6周Bcl-2/Bax明顯降低，差異具有非常顯著性(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中PP結(jié)淋巴細(xì)胞Bax和Bcl-2mRNA的變化

2.4 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)PP結(jié)淋巴細(xì)胞Cyt C質(zhì)量濃度的影響

結(jié)果顯示，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，2、4、6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞Cyt C濃度分別為(3.859±0.241)、(8.456±0.289)、(8.143±0.286) ng/mL，明顯高于與0周的(1.675±0.205) ng/mL，差異具有非常顯著性(P<0.01)；4和6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞Cyt C濃度明顯高于2周的，差異具有非常顯著性(P<0.01)。

3 討論

3.1 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中線粒體膜電位與PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡及機(jī)制

本研究探討了6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中PP結(jié)淋巴細(xì)胞ΔΨm的變化。結(jié)果顯示，在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，2、4、6周的ΔΨm明顯低于0周，且4周的降低最明顯，提示在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)降低了PP結(jié)淋巴細(xì)胞的ΔΨm，導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞凋亡的增加。

運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡及凋亡機(jī)制的研究報(bào)道非常少。ΔΨm的降低與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。其可能機(jī)制為：線粒體不但是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，而且是細(xì)胞凋亡信號(hào)的提供者。ΔΨm是觀察線粒體通透性，評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)[8]。ΔΨm的降低表明線粒體內(nèi)膜的通透性增加，細(xì)胞受損[4]。線粒體功能改變與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，包括線粒體膜電位的喪失、胞漿內(nèi)鈣失衡、活性氧(ROS)過(guò)度生成、細(xì)胞色素C的釋放及細(xì)胞Bcl-2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與[9]。當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)傳遞至線粒體，同時(shí)激活第2信使如Ca2+、Bcl-2(Bax)、神經(jīng)酰胺和活性氧等，第2信使也作用于線粒體，使線粒體釋放出 Cyt-c，Cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和 Caspases-9形成復(fù)合體，導(dǎo)致 Caspases-9的激活，激活 Caspases-9繼續(xù)激活下游效應(yīng)因子Caspases-3、6、7，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡[10-11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)期間，腸道淋巴細(xì)胞凋亡程度與組織自由基含量變化基本一致，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激性自由基生成與腸道淋巴結(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。與本研究相結(jié)合，說(shuō)明遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致自由基過(guò)度生成，線粒體氧化酶活性下降，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使內(nèi)膜的流動(dòng)性下降和膜通透性增加，滑扣、質(zhì)子漏和電子漏增加，導(dǎo)致線粒體膜電位降低甚至喪失，促使了PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Krüger等[12]以C57BL/6為研究對(duì)象，進(jìn)行一次力竭性遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡在運(yùn)動(dòng)后3、24 h明顯增加；MDA水平升高，ROS增加；Fas+和FasL+也明顯增加。另外，以Fas缺陷MRL/lpr小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)下，脾臟、肺、骨髓和淋巴結(jié)處淋巴細(xì)胞凋亡被阻止，而PP結(jié)淋巴細(xì)胞仍有凋亡出現(xiàn)，說(shuō)明介導(dǎo)PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的可能是其他凋亡途徑，如運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)血清糖皮質(zhì)激素濃度提高、自由基生成過(guò)度等。另外，Bax和Bcl-2的變化趨勢(shì)與上述ΔΨm的變化趨勢(shì)是一致的，且在一定誘導(dǎo)條件先，會(huì)促使 Bax寡聚體形成并整合到線粒體外膜上，使線粒體發(fā)生一系列變化，說(shuō)明在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，Bax和Bcl-2也可能參與了PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

3.2 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的 Bax、Bcl-2、Cyt C與PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡及機(jī)制

Bcl-2家族是目前最受關(guān)注的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，目前共發(fā)現(xiàn)30個(gè)成員。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，編碼的蛋白包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL等，促進(jìn)凋亡蛋白包括Bax、Bcl-10、Bid等[5]。Bax蛋白與Bcl-2蛋白具有氨基酸順序上的同源性，二者形成復(fù)雜二聚體，對(duì)抗Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax比值決定著細(xì)胞受到刺激后是發(fā)生凋亡還是幸存。如果 Bcl-2/Bax比值降低，會(huì)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素 C，激活下游因子，裂解底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡率達(dá)到峰值時(shí)，Bax蛋白表達(dá)也最強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2與Bcl-XL蛋白則明顯下降，即Bax、Bcl-2與Bcl-XL在淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的遞增，從0周到4周，PP結(jié)淋巴細(xì)胞BaxmRNA表達(dá)持續(xù)增加，6周BaxmRNA表達(dá)比4周略有降低，但明顯高于0周；第4和6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)明顯低于0周，4周的降低最顯著；2、4和6周PP結(jié)淋巴細(xì)胞Bcl-2/Bax值也明顯低于0周，尤其4周最低。即遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，尤其在0至4周，機(jī)體對(duì)負(fù)荷的反應(yīng)較大，到6周反應(yīng)略有減小，提示機(jī)體的運(yùn)動(dòng)機(jī)能可能提高了。與課題組前期研究結(jié)果是一致的[2]。另外，在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，0至4周隨著負(fù)荷的加大，Cyt C質(zhì)量濃度明顯增加。Cyt C具有激活caspase的作用，是線粒體參與凋亡的直接證據(jù)。

Bax、Bcl-2和Cyt C與PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：正常情況下，Bax以單體形式存在于胞質(zhì)，但隨著遞增負(fù)荷的進(jìn)行，PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡蛋白BaxmRNA表達(dá)增加，可能會(huì)導(dǎo)致Bax寡聚體形成并整合到線粒體外膜上，使線粒體外膜通透性增加，線粒體膜電位降低，使游離的Cyt-c釋放至胞質(zhì)，通過(guò)激活一系列下游基因發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，使 PP結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡增加。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致自由基過(guò)度生成，丙二醛(MDA)生成量增加，超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低[2]，也可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)的增加，進(jìn)而引起線粒體膜電位的改變，Cyt-c釋放增加，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致小腸集合淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞 Bax基因表達(dá)增加，Bcl-2基因表達(dá)降低，Bcl-2/Bax值降低，線粒體膜電位明顯降低，Cyt-c釋放增加，小腸集合淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡增加。其凋亡的可能機(jī)制為：遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致自由基過(guò)度生成，超氧化物歧化酶活性降低，促使抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA表達(dá)下降，凋亡蛋白BaxmRNA表達(dá)增加，其寡聚體形成并整合到線粒體上，引起線粒體外膜通透性改變，線粒體膜電位下降，使游離的Cyt-c釋放至胞質(zhì)增加，進(jìn)入胞質(zhì)的Cyt-c引起線粒體凋亡通路的下游基因發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，使淋巴細(xì)胞凋亡增加。因此，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能是通過(guò)線粒體通路介導(dǎo)小腸集合淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡的。

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