運動提高糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表達的信號機制

張紅學

（鄭州大學 體育學院，河南 鄭州 450044）

大量研究表明運動可以提高骨骼肌葡萄糖運載體4(glucose transporter 4，GLUT4)的表達[1-3]，這對治療以胰島素抵抗為主要病因的糖尿病有重要作用[4-5]，但機制尚不清楚。凝膠遷移(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實驗，顯示了GLUT4啟動子區(qū)域存在肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)的結合位點[6]。Thai等[7]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠骨骼肌MEF2和GLUT4 結合活性及GLUT4mRNA表達量均顯著低于正常大鼠，而用胰島素刺激糖尿病大鼠骨骼肌細胞之后，發(fā)現(xiàn) MEF2和 GLUT4 結合活性及GLUT4表達量均恢復到正常大鼠水平，提示了MEF2和GLUT4結合活性的變化是影響糖尿病大鼠GLUT4表達失常的重要環(huán)節(jié)[8]。雖然我們以往的研究結果也顯示了運動通過提高骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性而提高GLUT4基因表達[10]，但此機制未在糖尿病患者中得到證實。Mukwevho[9]的研究發(fā)現(xiàn)利用細胞鈣離子調(diào)節(jié)子 Caffeine 孵育激活 C2C12肌細胞鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶 II(calcium-calmodulin depen-dent protein kinase II，CAMKII)，可以引起肌細胞核內(nèi) MEF2和GLUT4結合活性顯著增加，且這種增加伴隨著GLUT4基因和蛋白的表達量的提高。運動能夠激活CAMKII[11]，提示了運動可能通過激活CaMKII而提高糖尿病大鼠MEF2和GLUT4結合活性和GLUT4表達的增加。值得注意的是，離體研究結果并不一定能真實反映在體的真實狀況。因此本實驗通過KN93(CaMKⅡ的特異性抑制劑)抑制運動對糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II的激活作用，研究在體運動情況下CAMK II對糖尿病大鼠MEF2和GLUT4結合活性和GLUT4表達的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗以100只12~14周齡，健康清潔級SD大鼠為研究對象，河南省實驗動物中心提供。試驗期間，室內(nèi)溫度保持在 20~25 ℃，相對濕度保持在50%~70%，每天光照12 h。正常飼養(yǎng)的1周時間內(nèi)所有大鼠自由進食(普通飼料)和飲水。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨即選出40只作為正常對照，繼續(xù)以普通飼料飼養(yǎng)。其余60只擬建立糖尿病大鼠模型。方法如下[12]：以高質(zhì)飼料(碳水化合物和脂肪各占41%，蛋白質(zhì)占18%，均為質(zhì)量比)飼養(yǎng)4周，并禁食 12 h(晚上)后，腹腔下注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STE)，注射質(zhì)量分數(shù)為30 mg/kg(檸檬酸鈉-檸檬酸鹽緩沖液配置，pH＝4.2)，STE購于 Sigma公司。注射后繼續(xù)給予高脂飼料，自由飲水。72 h后測定空腹血糖濃度(測血糖濃度之前禁食12 h)，凡血糖濃度大于6.7 mmol/L者視為造模成功，成功共35只。

1.3 運動方案和取材

實驗安排在第6周進行，實驗前1 d進行1~2次適應性跑臺練習，并于當天晚上 24：00禁食(耐力訓練組不禁食)。實驗當天根據(jù)體重正常對照大鼠和糖尿病組大鼠各自隨機分為5組：安靜對照(control，C)、一次性運動組、一次性運動+KN93組、耐力訓練組、耐力訓練+KN93組。正常對照大鼠每組8只，糖尿病大鼠每組7只。

安靜對照組和一次性運動組大鼠，分別于取材前和運動前0.5 h腹腔注射生理鹽水。一次性運動+KN93組大鼠運動前0.5 h腹腔注射KN93。注射質(zhì)量分數(shù)為5 mg/kg，KN93購于Sigma公司。一次性運動組大鼠采用坡度為10°的跑臺運動，跑臺速度為20 m/min(根據(jù)Armstrong[13]的公式y(tǒng)=1.25x+47.7(y為VO2max百分比；x為跑臺速度)，本研究采用的相對強度是 72%VO2max強度)，運動時間1 h。耐力訓練組大鼠采用同樣的跑臺運動方式，每天1 h，持續(xù)1周。根據(jù)預實驗結果一次性運動組大鼠運動后3 h取材，耐力訓練組大鼠最后一次訓練后12 h取材，乙醚麻醉后取右側(cè)股四頭肌，迅速投入液氮，再轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存。

1.4 指標測定方法

1)CaMK II磷酸化水平。

取大鼠股四頭肌100 mg，液氮研磨，移入離心管并加入1 mL蛋白裂解液，冰上靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，取上清。蛋白含量采用pierce公司的BCA蛋白定量試劑盒測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標蛋白(P-CaMKII和β-actin)，再將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉。一抗(P-CaMKII，β-actin) 4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。曝光前加入發(fā)光液，暗處反應1 min，暗室壓片曝光。生物電泳圖像分析軟件拍照，Image J軟件讀取蛋白的積分灰度值，結果以積分灰度值的比值表示。

2)GLUT4 mRNA表達。

大鼠股四頭肌100 mg，液氮研磨后，1 mL Trizol冰上靜置10 min，0.2 mL氯仿冰上靜置5 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，等體積異丙醇室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，1 mL體積分數(shù)為75%酒精，4 ℃ 7 500 r/min離心10 min，棄上清，10 μL EDPC水溶解mRNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應條件：75 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。實時定量部分采用ABI公司熒光染料反應混合體系試劑盒。加入目的基因的 cDNA模板后，再分別加入GLUT4的引物和β-actin的引物，進行實時定量。所需引物由上海生工合成。實時定量數(shù)據(jù)由ABI實時定量7500 PCR儀測得，數(shù)據(jù)由儀器自帶分析軟件分析完成。mRNA表達結果以比較CT法相對定量[14]。

3)MEF2和GLUT4結合活性。

EMSA法測定MEF2和GLUT4結合活性。Pierce核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，Pierce蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠預電泳20 min后，配置10 μL上樣體系(4 μL三蒸水、2 μL細胞核蛋白、2 μL標記探針、2 μL 5X EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液)。加入標記探針后，混勻，室溫放置20 min，再加入2 μL EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液，混勻后立即上樣。電泳電壓按照10 V/cm設置。電泳至上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠下1/4處。Western所使用的電轉(zhuǎn)膜裝置，0.5XTBE為轉(zhuǎn)膜液，把膠上的探針或蛋白以及探針和蛋白的復合物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。紫外交聯(lián)儀254 nm紫外波長交聯(lián)45~60 s。封閉液封閉15 min，加入一定量抗生物素蛋白鏈菌素+辣根過氧化物酶復合物，搖床上搖動15 min，并洗滌4次后，暗室曝光。生物電泳圖像分析軟件拍照，ImageJ軟件讀取蛋白的積分灰度值。結果以積分灰度值的比值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計分析使用SPSS 13.0統(tǒng)計學分析軟件完成。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。同一指標之間比較采用單因素方差分析。顯著性水平為P<0.05。

2 試驗結果及分析

2.1 CaMK II磷酸化水平

由圖1、圖2看出，正常對照及糖尿病大鼠一次性運動組，CaMK II磷酸化水平與安靜對照組相比分別升高了96%和140%(P<0.05)。正常對照及糖尿病大鼠一次運動+KN93組，CaMK II磷酸化水平與一次性運動組相比分別降低了 37%和 48%(P<0.05)，且與安靜對照組相比差異均沒有顯著性(P>0.05)。

圖1 P-CaMKII蛋白表達圖譜

圖2 CaMK II磷酸化水平

2.2 GLUT4基因表達量

由圖3看出，正常對照大鼠一次性運動組及耐力訓練組，骨骼肌GLUT4基因表達量與安靜對照組相比分別升高了54%和172%(P<0.05)。一次運動+KN93組，骨骼肌 GLUT4基因表達量與一次性運動組相比降低了27%(P<0.05)，耐力訓練+KN93組，骨骼肌GLUT4基因表達量與耐力訓練組相比沒有顯著差異(P>0.05)。糖尿病大鼠一次性運動組，骨骼肌GLUT4基因表達量與安靜對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，耐力訓練組，骨骼肌GLUT4基因表達量與正常對照大鼠耐力訓練組相比低了36%(P<0.05)，但與安靜對照組相比升高了145%(P<0.05)。耐力訓練+KN93組，骨骼肌GLUT4基因表達量與耐力訓練組相比降低了29%(P<0.05)，但與安靜對照組相比仍升高了74%(P<0.05)。

圖3 GLUT4基因表達量(相對值)

2.3 MEF2-GLUT4結合活性

由圖4看出，正常對照大鼠一次性運動組及耐力訓練組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與安靜對照組相比分別升高了 113%和 244%(P<0.05)。一次運動+KN93組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與一次性運動組相比降低了42%(P<0.05)，耐力訓練+KN93組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與耐力訓練組相比沒有顯著差異(P>0.05)。糖尿病大鼠一次性運動組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與安靜對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，耐力訓練組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與安靜對照組相比升高了157%(P<0.05)。耐力訓練+KN93組，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性與耐力訓練組相比降低了51%(P<0.05)，且與安靜對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

圖4 MEF2和GLUT4結合活性(相對值)

3 討論

GLUT4作為骨骼肌中葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的重要轉(zhuǎn)運蛋白，研究顯示它的表達量失常是胰島素抵抗的重要原因。而對于糖尿病患者來說，胰島素抵抗是其中的重要環(huán)節(jié)[15-16]。運動可以提高GLUT4基因和蛋白的表達，那么運動對胰島素抵抗的糖尿病患者骨骼肌GLUT4含量會產(chǎn)生什么影響呢。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠1 h跑臺運動后，其骨骼肌GLUT4基因表達量并沒有顯著升高，而1周耐力訓練之后，其骨骼肌GLUT4基因表達量雖然顯著低于正常對照大鼠耐力訓練組，但與糖尿病大鼠安靜對照組相比已經(jīng)顯著升高，提示了雖然單純的一次性運動可能并不能改善糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表達的缺陷，但經(jīng)過一定時期的訓練完全可以起到改善糖尿病大鼠GLUT4基因表達的作用，這對預防和治療胰島素抵抗有重要作用[17-18]，但機制尚不清楚。

MEF2是最早在骨骼肌管核發(fā)現(xiàn)的一種能識別基因啟動子、增強子或特定序列而調(diào)控基因表達的蛋白質(zhì)。近年來大量離體和在體的研究均顯示轉(zhuǎn)錄因子MEF2和GLUT4啟動子區(qū)域MEF2結合位點結合，為GLUT4蛋白轉(zhuǎn)錄所必須[6-7]。雖然利用了兩種不同的蛋白質(zhì)和DNA結合活性測試方法，Smith等[8，19]的研究均顯示了運動后MEF2和GLUT4結合活性顯著提高。提示了運動通過提高MEF2和GLUT4的結合活性而提高骨骼肌GLUT4的表達。對于糖尿病大鼠來說，本實驗發(fā)現(xiàn)一周耐力訓練之后，其骨骼肌GLUT4表達提高的同時同樣伴隨著骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4結合活性的顯著提高，提示了運動同樣通過提高糖尿病大鼠骨骼肌 MEF2和 GLUT4結合活性而提高骨骼肌GLUT4的表達。而試驗中糖尿病大鼠1次性跑臺運動后，MEF2和GLUT4結合活性及GLUT4mRNA表達量均與安靜對照組無顯著性差異，可能為此推測提供了進一步的證據(jù)。

CAMK是一類廣泛分布的絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，研究顯示CAMKⅡ活性與THR286 位點的磷酸化水平呈高度正相關[20]。本實驗中大鼠一次性跑臺運動后，骨骼肌 CaMKⅡTHR286位點磷酸化水平顯著升高，與以往研究的結果運動可以提高 CaMKⅡ活性相一致[20]。本試驗中，運動+KN93組大鼠一次性跑臺運動后，骨骼肌 CaMKⅡ活性顯著低于跑臺運動組，說明了 KN93抑制了運動對 CaMKⅡ的激活作用[21-22]。Smith等[8]的研究發(fā)現(xiàn)高表達具有穩(wěn)定 CAMK II活性(constitutively active)的肌管細胞，其 MEF2和 GLUT4結合活性顯著高于高表達顯性CAMK II失活(dominant negative)的肌管細胞。Mukwevho等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，利用Caffeine 孵育激活C2C12肌管細胞CAMK II活性，可以引起肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4結合活性顯著增加，而如果預先在培養(yǎng)基中加入CAMK II活性抑制劑KN93，這種變化消失，提示了CaMK II可能參與調(diào)節(jié)運動誘導的MEF2和GLUT4結合活性和GLUT4表達的增加。本實驗中正常對照大鼠，1次性跑臺運動+KN93其骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性及骨骼肌GLUT4基因表達量均顯著低于1次性跑臺運動組，與實驗假設及以往研究結果[8-9]相一致。

Zheng等[23]利用GLUT4氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶報告基因轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染包含位于 GLUT4啟動子區(qū)域MEF2結合位點序列，并利用腺苷酸活化的蛋白激酶(5’-AMP activated protein kinase，AMPK)的藥理激活劑AICAR(5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside)刺激小鼠骨骼肌細胞后，發(fā)現(xiàn)GLUT4氯霉素?；D(zhuǎn)移酶報告基因活性顯著增加。進一步的 EMSA實驗也發(fā)現(xiàn)AICAR刺激組小鼠骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4結合活性也顯著高于生理鹽水組[23-24]。由于AICAR并不是AMPK的特異性激活劑[25]，我們以往的研究利用轉(zhuǎn)基因技術制造出 AMPK高表達轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)由于AMPKα2的高表達，1 h跑臺運動后，AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細胞核內(nèi) MEF2和GLUT4結合活性及GLUT4基因表達量，均比野生鼠增加更為顯著[19]。據(jù)此我們推測，CAMK II和AMPK可能均參與調(diào)節(jié)了運動后MEF2和GLUT4結合活性及GLUT4基因表達的增多，當其中一個通路長期受到抑制時，另外一個通路可能被激活從而代償了受抑制通路對MEF2和GLUT4結合活性及GLUT4基因表達的調(diào)節(jié)作用。我們以往的實驗結果AMPKα2基因敲除小鼠4周耐力后，骨骼肌MEF2和GLUT4結合活性及GLUT4基因表達量與野生鼠差異均沒有顯著性[19]；本實驗中耐力訓練+KN93組大鼠，其骨骼肌細胞核內(nèi) MEF2和GLUT4的結合活性及骨骼肌GLUT4基因表達量與耐力訓練組均沒有顯著差異，可能為此推測提供了進一步的證據(jù)。

對于糖尿病大鼠來說，實驗發(fā)現(xiàn)耐力訓練+KN93組糖尿病大鼠骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性顯著低于耐力訓練組，提示了運動同樣通過激活糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II而提高其骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性。而值得注意的是雖然耐力訓練+KN93組糖尿病大鼠骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性與安靜對照組相比沒有顯著差異，但其骨骼肌 GLUT4基因表達量與安靜對照組相比卻顯著升高，提示了對于糖尿病大鼠來說，MEF2和GLUT4的結合活性并不是影響其GLUT4表達的唯一因素，與正常大鼠實驗結果不一致。Thai[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，敲除GLUT4啟動子區(qū)域上MEF2結合位點序列，雖然GLUT4mRNA表達會有所減低，但仍高于糖尿病大鼠mRNA表達水平，提示了GLUT4啟動子區(qū)域還存在著未知的轉(zhuǎn)錄因子結合位點，未知的轉(zhuǎn)錄因子與此位點結合而調(diào)節(jié)GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄。通過DNA序列同源性分析，Oshel[26]的研究發(fā)現(xiàn)，位于GLUT4啟動子區(qū)域，長度為60對（-712/-772）堿基片段，具有90%以上的同源性，推測此區(qū)域可能存在轉(zhuǎn)錄因子結合位點。通過進一步的 DNaseⅠ足跡實驗分析發(fā)現(xiàn)，-742/-712堿基序列對應部位有蛋白質(zhì)與之結合，Oshel把此段序列命名為Domain 1區(qū)域。利用GLUT4螢火素酶報告基因轉(zhuǎn)染 C2C12肌細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Domain 1區(qū)域堿基片段時，熒光素酶活性顯著增加，說明其片段對于 GLUT4的表達有著重要作用。隨后Oshel利用酵母單雜交技術篩選到與Domain區(qū)域序列的結合蛋白，并根據(jù)此蛋白功能命名為GLUT4增強因子(GLUT4 enhance factor，GEF)。事實上，近年來GEF對GLUT4表達的調(diào)節(jié)作用研究不是很多，再加上本實驗研究并沒有測定骨骼肌細胞核內(nèi)GEF和GLUT4的結合活性，所以我們只能推測GEF可能參與調(diào)節(jié)了訓練引起糖尿病大鼠GLUT4基因表達的提高，并以此來解釋耐力訓練+KN93組大鼠骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性與安靜對照組相比沒有顯著差異，而其骨骼肌 GLUT4基因表達量與正常對照組卻顯著升高，具體機制有待進一步研究。

運動通過激活糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II而提高其骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2和GLUT4的結合活性，雖然MEF2和GLUT4的結合活性參與調(diào)節(jié)了正常大鼠骨骼肌GLUT4基因表達，但并不是影響糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表達的唯一因素。

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