紅櫸不同種源核rDNA的ITS序列克隆與親緣關(guān)系

王旭軍， 程 勇， 吳際友， 張玖榮， 劉偉強(qiáng)

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004; 2.桑植縣林業(yè)局, 湖南 桑植 427100)

紅櫸不同種源核rDNA的ITS序列克隆與親緣關(guān)系

王旭軍1， 程 勇1， 吳際友1， 張玖榮2， 劉偉強(qiáng)1

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004; 2.桑植縣林業(yè)局, 湖南 桑植 427100)

通過(guò)克隆和測(cè)定核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Ribosomal DNA internal transcribed spacer，rDNA，ITS)基因序列，研究紅櫸不同種源間的親緣關(guān)系。測(cè)定結(jié)果表明：紅櫸5個(gè)種源的ITS序列、ITS1和ITS2長(zhǎng)度變異范圍分別為561～623 bp、157～210 bp和215～222bp。軟件DNAMAN、遺傳距離和UPGMA法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明：南京種源與贛州種源的親緣關(guān)系較近，湖州種源與懷化種源的親緣關(guān)系較近；滁州種源單獨(dú)聚為一類，與湖州、懷化種源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

紅櫸； 種源； ITS； 親緣關(guān)系

高等植物的細(xì)胞核中，核糖體DNA(rDNA)是由18S、5.8S和26S串聯(lián)在一起的高度重復(fù)序列單位，而其間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Space，ITS)與編碼區(qū)相比較，所受的選擇壓力小，進(jìn)化速率較快[1]；同時(shí)，采用ITS構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，比RAPD、AFLP、SSR和SRAP等技術(shù)更省時(shí)、省工，且結(jié)果也更加可靠[2]。因此，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列常常作為一種遺傳標(biāo)記，用來(lái)研究植物的系統(tǒng)發(fā)育[3-7]。紅櫸為大葉櫸(ZelkovaschneiderianaHand-Mazz．)俗稱，為榆科櫸屬落葉大喬木樹(shù)種，因其材色淺紅而得名，屬國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。紅櫸生長(zhǎng)較快，其材質(zhì)堅(jiān)硬有彈性，紋理美觀有光澤，結(jié)構(gòu)細(xì)致，為我國(guó)珍貴硬闊葉用材樹(shù)種。同時(shí)，紅櫸樹(shù)冠寬闊，樹(shù)形優(yōu)美，葉色季相變化豐富，春葉嫩綠，夏葉深綠，秋葉橙紅，觀賞價(jià)值高，是深受人們喜愛(ài)的傳統(tǒng)色葉園林樹(shù)種。此外，紅櫸還是藥用、化工原料等方面的重要原料樹(shù)種[8～11]。目前，關(guān)于紅櫸的研究主要集中在壯苗培育、高效栽培等方面[12～16]，而其種源親緣關(guān)系的研究較少見(jiàn)。因此，本文對(duì)比分析了不同紅櫸種源的ITS序列, 旨在研究紅櫸不同種源間的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系, 為紅櫸的引種、育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用材料為湖南懷化、浙江湖州、江西贛州、江蘇南京和安徽滁州等5個(gè)紅櫸種源的2年生幼樹(shù)葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 植物基因組DNA提取采取改進(jìn)CTAB法。

1.2.2 PCR擴(kuò)增ITS序列及產(chǎn)物純化

(1) PCR擴(kuò)增。ITS引物參照White等[17-18]的通用引物。引物序列：上游引物F(ITS5)為GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，下游引物R(ITS4)為T(mén)CCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴(kuò)增程序： 94℃下預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s， 72℃延伸30s，循環(huán)38次； 72℃延伸5min。PCR體系組分見(jiàn)表1。

表1 PCR體系組分Tab.1 ReactionsystemofPCR組分使用量(μL)DNA(30～50ng/μL)2.010×Buffer(25mM)2.5Mg2+(25mM)1.5TaqDNApolymerase(2u/μL)0.5dNTPMIX(10mM)0.5PrimerF(ITS5)(10μM)0.75PrimerR(ITS4)(10μM)0.75ddH2O16.5

(2) 測(cè)序。測(cè)序由上海生化工程技術(shù)服務(wù)公司完成。先使用通用引物M13在PTC-200上進(jìn)行PCR反應(yīng)，再用ABI3730全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

將提取的紅櫸基因組DNA在1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。據(jù)圖1可知，提取的所有種質(zhì)基因組DNA電泳30min后，在凝膠成像系統(tǒng)下可見(jiàn)其DNA條帶清晰，與MARKER進(jìn)行比較，估計(jì)濃度約為50ng/μL，但含有少量RNA與蛋白質(zhì)，可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNAFig.1 Extracted genome DNA of agarose gel electrophoresis

2.2 PCR產(chǎn)物回收與克隆

用提取的紅櫸基因組DNA作為模板，采用ITS引物擴(kuò)增ITS序列，結(jié)果見(jiàn)圖2a。據(jù)圖2a可知，PCR擴(kuò)增后條帶清晰，擴(kuò)增效果都較好，其中4號(hào)反應(yīng)體系最為理想，可采用該體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。據(jù)圖2b可知，5個(gè)不同種源的PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物長(zhǎng)度差異不明顯，都在500～750bp之間，且條帶清晰，無(wú)雜帶，適合進(jìn)行連接克隆。

圖2 PCR產(chǎn)物及其純化后檢測(cè)圖Fig.2 PCR products and theirs detection diagrams

圖3顯示，在AMP篩選培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出有多個(gè)轉(zhuǎn)化后大腸桿菌克隆，菌斑邊緣清晰，長(zhǎng)勢(shì)好，連接效果較為理想，僅有少量藍(lán)色菌斑，表明仍有少量假陽(yáng)性質(zhì)粒，沒(méi)有連接上PCR產(chǎn)物。

2.3 連接有PCR產(chǎn)物的重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定

將提取的質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示(6～10泳道)。圖4中跑在最前面，條帶最亮的是超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，大小2000bp左右，跑在中間的質(zhì)粒為環(huán)狀質(zhì)粒，濃度相對(duì)較低，跑在最后面的質(zhì)粒是直線形重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4(1～5泳道)，1、3和5號(hào)泳道可能是因?yàn)槊盖胁煌耆@示仍有三條帶，最短帶在750bp左右，最長(zhǎng)帶在2000bp左右。酶切結(jié)果表明，連接轉(zhuǎn)化效果較為理想，PCR產(chǎn)物已成功導(dǎo)入質(zhì)粒，挑取菌的斑帶有目標(biāo)ITS片段。

圖3 重組菌在含氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)Fig.3 Growth of recombinant E.coli on ampicillin media

2.4 ITS序列分析

5個(gè)紅櫸不同種源的ITS序列測(cè)序結(jié)果及ITS序列(包括5.8S在內(nèi))對(duì)比分析結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，5個(gè)種源的ITS序列的長(zhǎng)度范圍是561～623bp，相差62bp，長(zhǎng)度變異為9.95%，其中南京種源序列最長(zhǎng)，為623bp。對(duì)序列長(zhǎng)度分析可知，ITS1變化范圍是157～210bp，ITS2變化范圍是215～222bp，這5個(gè)種源ITS2都比ITS1長(zhǎng)。5.8S序列相對(duì)保守，僅滁州種源為149bp，其他均為159bp，變化小。

圖4 重組質(zhì)粒與雙酶切檢測(cè)圖Fig.4 The restriction analysis of recombinant plasmids

用軟件DNAMAN對(duì)5個(gè)紅櫸種源的ITS序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可知，湖州種源與懷化種源、南京種源、贛州種源及滁州種源的相似性分別為91.7%、89.5%、88.3%和79.5%；懷化種源與南京種源、贛州種源和滁州種源的相似性分別為88.5%、88.1%和79.6%；南京種源與贛州種源、滁州種源的相似性分別為93.3%和83.8%；贛州種源與滁州種源的相似性為85.6%。可見(jiàn)，湖州種源和懷化種源、南京種源與贛州種源均屬于高度相似，而其它種源兩兩之間則均呈現(xiàn)中度相似。

表3 紅櫸不同種源序列相似度和遺傳距離Tab.3 Geneticdistanceandidentityamongdifferentprovenances湖州HZ懷化HH南京NJ贛州GZ滁州CZ湖州HZ—91.789.588.379.5懷化HH0.083—88.588.179.6南京NJ0.1050.115— 93.383.8贛州GZ0.1170.1190.067— 85.6滁州CZ0.2050.2040.1620.144— 注:對(duì)角線下為遺傳距離,對(duì)角線上為相似性(%)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

紅櫸種源間的遺傳距離用軟件MEGA 4.0分析，其結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，湖州種源與懷化種源的遺傳距離為0.083，湖州種源與南京種源、贛州種源的遺傳距離分別為0.105和0.117，湖州種源與滁州種源的遺傳距離為0.205；懷化種源與南京種源、贛州種源的遺傳距離分別為0.115和0.119，懷化種源與滁州種源的遺傳距離為0.204；南京種源與贛州種源的遺傳距離為0.067，南京種源與滁州種源的遺傳距離為0.162。表明，南京種源與贛州種源的親緣關(guān)系最近，湖州種源與滁州種源的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，懷化種源與滁州種源的親緣關(guān)系也相對(duì)較遠(yuǎn)。

采UPGMA法獲得紅櫸不同種源發(fā)育樹(shù)(圖5)。由圖5可知，南京種源與贛州種源的親緣關(guān)系較近，湖州種源與懷化種源的親緣關(guān)系較近，而滁州種源則單獨(dú)聚為一類。這些與遺傳距離分析結(jié)果一致。

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的紅櫸不同種源UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of different provenances by UPGMA

3 結(jié)論

(1) 5個(gè)紅櫸種源的ITS序列的長(zhǎng)度為561～623bp，ITS1序列的變異范圍在157～210bp之間，ITS2序列的變異范圍在215～222bp，ITS2都比ITS1長(zhǎng)；5.8S序列相對(duì)保守，僅滁州種源為149bp，其他為159bp，變化小。

(2) 用軟件DNAMAN對(duì)5個(gè)紅櫸種源的ITS序列進(jìn)行兩兩比對(duì)得出，湖州種源和懷化種源、南京種源與贛州種源均屬于高度相似，而其它種源兩兩之間則均呈現(xiàn)中度相似。

(3) 遺傳距離和UPGMA法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析結(jié)果一致，即南京種源與贛州種源的親緣關(guān)系較近，湖州種源與懷化種源的親緣關(guān)系較近；滁州種源單獨(dú)聚為一類，與湖州、懷化種源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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(文字編校：唐效蓉)

DeterminationofnucleotidesequencesofribosomalDNAinternaltranscribedspacerinZelkovaschneiderianacollectedfromdifferentprovenances

WANG Xujun1, CHENG Yong1, WU Jiyou1, ZHANG Jiurong2, LIU Weiqiang1

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China; 2.Forestry Bureau of Sangzhi County, Sangzhi 427100, China)

The genetic relationship of different provenances ofZelkovaschneiderianawas investigated by cloning and measuring the sequences of the nucleotide sequences of ribosomal DNA internal transcribed spacers (ITS) collected from different parts of China. The results showed that the length of ITS sequence, ITS 1 and ITS 2 ranged 561～623 bp,157～210 bp and 215～222 bp, respectively. And the DNAMAN, genetic and UPGMA analysis revealed that the relationships between Nanjing provenance and Ganzhou provenance, and between Huzhou provenance and Huaihua provenance were closer than the others, and the Chuzhou provenances was clustered one single group.

Zelkovaschneideriana; provenance; ITS; genetic relationship

2013 — 05 — 19

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2011BAD38B03)。

王旭軍(1971 — )，男，湖南省雙峰縣人，主要從事城市森林和林木遺傳育種研究工作。

S 792.99

A

1003 — 5710(2013)04 — 0007 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 002