結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)四種注射用抗結(jié)核藥物耐藥及交叉耐藥分析

常珊 付育紅 李琦 卜建玲 黃海榮 馬玙 陳效友

WHO 2010年報(bào)告［1］，我國(guó)在耐多藥結(jié)核病患者數(shù)量最多的5個(gè)國(guó)家中居首位。2008年全國(guó)耐藥結(jié)核病基線調(diào)查報(bào)告指出［2］，我國(guó)結(jié)核病總耐藥率37．39%，耐多藥率8．32%，廣泛耐藥率0．68%，2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查［3］結(jié)果報(bào)告耐多藥率為6．8%，由此可估算我國(guó)近5年每年新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者約9．8萬(wàn)～12萬(wàn)例，遠(yuǎn)高出全球平均水平，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）和卷曲霉素（Cm）均屬于注射用抗結(jié)核藥物，是耐藥結(jié)核病治療方案中的重要組成部分。由于對(duì)這四種藥物之間的交叉耐藥關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，為了更好地使用這一類(lèi)藥物，組成更合理的耐藥結(jié)核病的治療方案，筆者對(duì)本院2004—2010年所有的臨床分離株的4種注射劑的耐藥情況進(jìn)行分析，并報(bào)告如下。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

4247份結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來(lái)自2004年1月至2010年12月北京胸科醫(yī)院就診4247例患者的痰液標(biāo)本，所有陽(yáng)性菌株經(jīng)對(duì)硝苯甲酸（PNB）及噻吩二羧酸肼（TCH）進(jìn)行菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌。其中：2004年256份，2005年353份，2006年335份，2007年631份，2008年711份，2009年988份，2010年973份。來(lái)源患者中男2629例，女1618例；年齡3～92歲，平均年齡（49．32±8．71）歲。

二、培養(yǎng)方法及藥物敏感試驗(yàn)

所有菌株采用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，兩濃度的絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，S、Km、Am和Cm的藥物敏感試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［4］，4種藥物耐藥菌株的入選均以每種藥物10μg／ml的含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落占據(jù)1／4斜面及以上（＋～＋＋＋＋）作為標(biāo)準(zhǔn)。4種藥物均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。質(zhì)控菌株為 H37Rv（ATCC27294）標(biāo)準(zhǔn)株，為本院參比實(shí)驗(yàn)室保存。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，4種藥物之間總耐藥率的差異采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)及χ2分割法，以P＜0．007 14為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種藥物之間交叉耐藥率的差異采用兩個(gè)樣本率比較的χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．總體耐藥情況：總計(jì)4247份標(biāo)本中，S的耐藥 率 為 45．11% （1916／4247），Km 的 耐 藥 率 為17．93% （718／4005），Am 的 耐 藥 率 為 19．02%（792／4164），Cm 的耐藥率為 9．44%（401／4247）。經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)，Cm與S、Am、Km之間耐藥率差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義，χ2值 分 別為 1349．34、281．54、193．16，P值均＜0．007 14。經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)，S與Am、Km之間耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值分別為821．10、869．28，P 值均＜0．007 14。經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)，Am與Km之間耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值為13．98，P 值＜0．007 14。因此，4種藥物的耐藥率以S的耐藥率最高，Cm的耐藥率最低，Am排在S之后，Km排在Am之后，即S＞Am＞Km＞Cm。4種藥物耐藥率在不同年份的具體數(shù)值及總體耐藥率的結(jié)果見(jiàn)表1。從近7年的耐藥率變化來(lái)看，S的耐藥率一直高于其他3種藥物，且較為穩(wěn)定，另外3種藥物的耐藥率在2008年及2009年出現(xiàn)了小幅度的升高，到2010年又有所下降。

表1 4247份標(biāo)本4種藥物的總耐藥率

2．交叉耐藥情況：（1）S在Km、Am和Cm 3種耐藥株中的 耐 藥 率 分 別 為 82．59% （593／718）、77．78%（616／792）和76．81%（308／401）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2值分別為502．959、453．911、626．654，P值均＜0．05。（2）Km在S、Am和Cm 3種耐藥株中的耐藥率分別為33．13%（593／1790）、83．31%（634／761）和67．89%（260／383）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2值 分 別 為 502．959、12．079、100．536，P 值 均＜0．05。（3）Am 在S、Km 和Cm 3種耐藥株的耐藥率分別為32．78%（616／1879）、89．55%（634／708）和77．95%（304／390）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2值分別為453．911、12．079、163．761，P 值均＜0．05。（4）Cm在S、Km和Am 3種耐藥株中的耐藥率分別為16．08%（308／1916）、36．21%（260／718）和38．38%（304／792）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2值分別為626．654、100．536、163．761，P 值均＜0．05。

討 論

本資料分析結(jié)果顯示，4種藥物總的耐藥率由高到 低 依 次 為 S （45．11%）、Am（19．02%）、Km（17．93%）、Cm （9．44%）。4種藥物耐藥率高低順序結(jié)果與2008年王生偉等［5］報(bào)道一致。施旭東等［6］2004年報(bào)道1046份改良羅氏培養(yǎng)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，S耐藥率30．3%，Km 耐藥率10．5%，Am耐藥率8．2%，Cm 耐藥率3．3%，本研究中4種藥物的耐藥率與之比較都偏高，可能與樣本量的大小、標(biāo)本來(lái)源于不同地區(qū)及4種藥物的近6年來(lái)使用頻率不同有關(guān)。本研究結(jié)果提示Am的耐藥率略高于Km耐藥率，與施旭東等［6］研究結(jié)果不同，可能與近幾年來(lái)Am的使用率高于Km有關(guān)。另從近7年耐藥率變化來(lái)看，4種藥物的耐藥率都呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，但2010年的耐藥率又有所回落。2010年全國(guó)第五次流調(diào)結(jié)果與2008年耐藥結(jié)核病基線調(diào)查報(bào)告的結(jié)果相比較，耐多藥率是有所下降的，本研究結(jié)果與此變化趨勢(shì)是一致的，2010年4種藥物耐藥率的下降可能與耐多藥結(jié)核病比率下降有關(guān)。

這4種藥物均為注射用抗結(jié)核藥物。除Cm為環(huán)多肽類(lèi)藥物外，其他3種均屬于氨基糖甙類(lèi)藥物。兩類(lèi)藥物均以抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成為主要機(jī)制，但作用靶點(diǎn)不完全相同［7］。自氨基糖甙類(lèi)藥物誕生起，即陸續(xù)出現(xiàn)對(duì)這類(lèi)藥物存在交叉耐藥現(xiàn)象的報(bào)道。交叉耐藥是指細(xì)菌對(duì)一種抗菌藥產(chǎn)生耐藥后，對(duì)其他作用機(jī)制相似的抗菌藥也產(chǎn)生耐藥性。通常認(rèn)為S與Km和Am為單向交叉耐藥，Km和Am之間為完全交叉耐藥，這3種藥物與Cm之間為單向交叉耐藥［7］。但文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果并非完全一致。1987年，巖井和郎等［8］認(rèn)為S與Km為單向交叉耐藥，但Km和Cm之間為完全交叉耐藥。倪正義等［9］報(bào)道，對(duì)Am低度耐藥的患者有92．1%對(duì)Km仍然有效，而對(duì)Km低度耐藥者僅36．4%對(duì)Am敏感。上海曹廣云等［10］報(bào)道448例藥敏結(jié)果顯示，S在Am耐藥株和Cm耐藥株中的耐藥率分別為96．7%和91．2%，而Am在S耐藥株中的耐藥率為31．2%，Cm在S耐藥株中的耐藥率為27．5%，因此可以認(rèn)為S與Am和Cm之間為單向交叉耐藥。而Am在Cm耐藥株中耐藥率為82．5%，Cm在Am耐藥株中的耐藥率為77%，因此認(rèn)為兩種藥物為雙向交叉耐藥。國(guó)外關(guān)于4種藥物的交叉耐藥情況結(jié)果也不完全一致，特別是Am和Km之間的交叉耐藥情況，差別較大，但通常樣本量較小。如Kruuner等［11］和 Maus等［12］的兩個(gè)研究報(bào)道各約80例樣本中，耐Km株中仍有50%左右對(duì)Am敏感。2009年Jugheli等［13］報(bào)道78例Km耐藥株中11．5%對(duì)Am敏感，20．5%對(duì)Cm敏感，而Am耐藥株中未見(jiàn)到Km敏感株。本研究結(jié)果顯示，S在另外3種藥物耐藥株中的耐藥率為76．81%～82．59%，而另外3種藥物在S耐藥株中的耐藥率為16．08%～33．13%，據(jù)此認(rèn)為S與另外3種藥物雖然存在交叉耐藥，但耐藥率差別較大，交叉耐藥水平較低，可認(rèn)為S與其他3種藥物之間均為單向交叉耐藥，與曹廣云等［10］研究結(jié)果一致。Cm在另外3種藥物耐藥株中的耐藥率為16．08%～38．38%，另外3種藥物在Cm耐藥株中的耐藥率為67．89%～77．95%，因此Cm與另外3種藥物之間也應(yīng)為單向交叉耐藥。2008年，耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南緊急修訂版中也認(rèn)為Cm和其他氨基甙類(lèi)藥物之間有低水平交叉耐藥［14］。最后，本研究結(jié)果顯示，Km耐藥株中Am的耐藥率為89．55%，Am耐藥株中Km的耐藥率為83．31%，兩者差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但χ2值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他幾組藥物，且從臨床實(shí)際出發(fā)，此交叉耐藥率的差別過(guò)小，應(yīng)認(rèn)為兩者為完全交叉耐藥。提示，在臨床用藥中，應(yīng)優(yōu)先推薦遵從S到Am到Cm的單向用藥順序，另當(dāng)S耐藥時(shí)可選擇使用Am或者是Km，當(dāng)Am和Km耐藥時(shí)可以選擇使用Cm。

目前研究認(rèn)為，4種藥物交叉耐藥產(chǎn)生的原因是由于存在共同的基因突變位置。如S的耐藥主要由于rspl和（或）rrs基因突變所致［15］。其他3種藥物耐藥均有rrs基因突變參與［13］。而Cm的耐藥產(chǎn)生與rrs、thyA及gidB3個(gè)基因突變均有關(guān)聯(lián)［16］。其中Km和Am的耐藥產(chǎn)生均與rrs1401位點(diǎn)的突變密切相關(guān)，特別是高濃度耐藥時(shí)，其基因型和表型的關(guān)聯(lián)更為密切［17，18］。多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道均發(fā)現(xiàn)不同形式、不同程度的交叉耐藥經(jīng)常表現(xiàn)為不同形式的基因突變［12，16，18］。但本研究并未對(duì)4種藥物耐藥株的相關(guān)耐藥基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)和分析，因此尚不能從基因水平說(shuō)明4種藥物交叉耐藥的分子機(jī)制。

從本研究所總結(jié)的7年的臨床資料來(lái)看，4種藥物的耐藥率從高到低依次為S、Am、Km、Cm，4種藥物之間均表現(xiàn)出交叉耐藥，但程度不同。S與其他3種藥物之間為單向耐藥，Km和Am兩個(gè)藥物之間近似完全交叉耐藥，Cm與其他3種藥物之間為單向耐藥。

［1］WHO．耐藥結(jié)核病臨床醫(yī)生使用指南．2版．北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治中心，2010．

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部．全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告（2007—2008年）．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010．

［3］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告．中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485-508．

［4］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)．結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程．中國(guó)防癆雜志，1996，18（1）：28-33．

［5］王生偉，張俠．1996—2006年南京地區(qū)結(jié)核病耐藥狀況分析．中國(guó)防癆雜志，2008，30（5）：408-410．

［6］施旭東，王雷．卷曲霉素對(duì)結(jié)核分枝桿菌體外抑菌作用的研究．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2004，14（2）：100-102．

［7］肖和平．唐神結(jié)．耐藥結(jié)核病防治手冊(cè)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009．

［8］島尾忠難．結(jié)核病學(xué)．北京：人民衛(wèi)生出版社，1987．

［9］倪正義，熊建剛，凡毅．丁胺卡那與卡那霉素對(duì)結(jié)核桿菌的交叉耐藥情況分析．醫(yī)師進(jìn)修雜志，2000，23（7）：10．

［10］曹廣云，肖和平，閆麗萍，等．三種注射用抗結(jié)核藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況分析．中國(guó)防癆雜志，2010，32（4）：227-230．

［11］Krüüner A，Jureen P，Levina K，et al．Discordant resistance to kanamycin and amikacin in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis． Antimicrob Agents Chemother，2003，47 （9）：2971-2973．

［12］ Maus CE，Plikaytis BB，Shinnick TM．Molecular analysis of cross-resistance to capreomycin，kanamycin，amikacin，and viomycin in Mycobacterium tuberculosis．Antimicrob Agents Chemother，2005，49（8）：3192-3197．

［13］Jugheli L，Bzekalava N，de Rijk P，et al．High level of cross-resistance between kanamycin，amikacin，and capreomycin among Mycobacterium tuberculosis isolates from Georgia and a close relation with mutations in the rrs gene．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5064-5068．

［14］WHO．耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南．2008年緊急修訂版．北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治中心，2008．

［15］吳雪瓊．結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素分子機(jī)制的研究進(jìn)展．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，1998，26（3）：83-85．

［16］Via LE，Cho SN，Hwang S，et al．Polymorphisms associated with resistance and cross-resistance to aminoglycosides and capreomycin in Mycobacterium tuberculosis isolates from South Korean patients with drug-resistant tuberculosis．J Clin Microbiol，2010，48（2）：402-411．

［17］Sirgel FA，Tait M，Warren RM，et al．Mutations in the rrs A1401Ggene and phenotypic resistance to amikacin and capreomycin in Mycobacterium tuberculosis．Microb Drug Resist，2012，18（2）：193-197．

［18］Georghiou SB，Magana M，Garfein RS，et al．Evaluation of genetic gutations associated with Mycobacterium tuberculosis resistance to amikacin，kanamycin and capreomycin：a systematic review．PLoS One，2012，7（3）：e33275．