蘿卜硫素增加HL-60和人原代白血病細(xì)胞對化療藥敏感性實(shí)驗(yàn)研究

許曉峰 張學(xué)進(jìn) 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤血液科 杭州 310003

程汝濱 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

高瑞蘭 浙江省中醫(yī)院血液病研究所

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜中存在的一些化合物具有抗癌活性，尤其是富含胡蘿卜素的蔬菜，胡蘿卜、西蘭花、椰菜及菠菜等[1-3]，這些蔬菜富含多種芥子苷，經(jīng)黑芥子硫酸苷酶酶解（myrosinase）或酸水解后產(chǎn)生蘿卜硫素。蘿卜硫素（sulforaphane，簡稱SF）是活力最強(qiáng)的一類異硫氰酸鹽，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌中得到充分證明[4]，其對實(shí)體腫瘤的研究比較深入，但對白血病的研究很少。曾有學(xué)者報道SF 對HL-60細(xì)胞有抑制作用[5]，但有關(guān)蘿卜硫素與白血病細(xì)胞藥物敏感性研究尚未見報道。因此，本研究采用白血病細(xì)胞體外集落形成藥敏試驗(yàn)法和MTT 法探討SF 與白血病化療藥物敏感性的關(guān)系，報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 靶細(xì)胞 HL-60 白血病細(xì)胞株：購自中科院上海細(xì)胞所。人原代白血病細(xì)胞：來自2010 年7 月-2012年11 月浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血液科住院患者，共17 例，男12 例，女5 例，年齡15～76 歲；初治3 例，復(fù)發(fā)14 例。均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)染色確診為髓系白血病，診斷均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]，按FAB 協(xié)作組分型確定M15 例，M210 例，M32 例。

1.2 主要試劑和藥品 蘿卜硫素（購自杭州臨安天鴻生物科技有限公司，純度98%，批號TH110720）；高三尖杉酯堿（Hom，杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；阿糖胞苷（Ara-c，杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；IMDM 培養(yǎng)基（Gibco）；青霉素鈉（山東魯抗制藥）；硫酸鏈霉素（華北制藥公司）；96 孔培養(yǎng)板（美國Becton）；四唑藍(lán)（上海生工）；二甲基亞砜（國產(chǎn)分析純）；無菌水（平沙普愛思制藥公司）。

1.3 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus）；移液器（P-20，P-200，法國Gilson）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；層流潔凈室（蘇州凈化）；低溫冰箱（日本三洋）；恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平（瑞士Mettler-toledo）；水平式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；酶標(biāo)儀（BIO-TEX INSTRUMENTS.INC）；游標(biāo)卡尺（上海精密儀器儀表公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) HL-60 白血病細(xì)胞株常規(guī)接種于含10%滅活小牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/mL的IMDM 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中懸浮培養(yǎng)，每2～3 天換液。實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

2.2 化療藥物 選擇臨床常用的Hom 和Ara-c，瓊脂半固體集落培養(yǎng)和MTT 法均經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)對白血病細(xì)胞克隆抑制的生長曲線，確定恰當(dāng)濃度用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 瓊脂半固體集落培養(yǎng)法 取對數(shù)生長期的HL-60 細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 抑制實(shí)驗(yàn) 經(jīng)1 000rpm/min 離心5min，收集細(xì)胞。2mL 培養(yǎng)體系含20%小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/mL，0.3%瓊脂的IMDM 培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組SF 的終濃度分別為5、10、20、40μmol/L，以不加SF為對照組。每濃度設(shè)3 個平行孔，接種細(xì)胞數(shù)均為2.0×102/0.5mL/孔。

2.3.2 協(xié)同實(shí)驗(yàn) 2mL 培養(yǎng)體系除含上述各組分外，再加入Hom，終濃度為5μg/L，抑制率為（20.2±6.7）%；加入Ara-c，終濃度為2μg/L，抑制率分別為（19.7±5.5）%，以不加SF 和化療藥物為對照組。

將上述不同組合的細(xì)胞均置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中，6 天后計數(shù)集落，根據(jù)各細(xì)胞株增殖潛能的不同，計數(shù)集落標(biāo)準(zhǔn)定為CFU-K562 和CFU-HL-60 集落（＞40 個細(xì)胞），并計算各實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%。

2.4 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)法[7]

2.4.1 抑制實(shí)驗(yàn) 觀察不同濃度SF 對人原代白血病細(xì)胞的作用。將未經(jīng)治療的急性髓系白血病(AML)患者的骨髓標(biāo)本沿試管壁加于淋巴細(xì)胞分離液上，1 500rpm/min 離心15min，吸取單個核細(xì)胞，單IMDM培養(yǎng)液洗滌1 次，離心棄上清，加入雙IMDM 培養(yǎng)液使成2×106/mL 的細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組SF 的濃度分別為5、10、20、40μmol/L，以不加SF 為對照組?？傮w積2mL，設(shè)3 個平行孔，接種細(xì)胞數(shù)為105/0.5mL/孔。

2.4.2 協(xié)同實(shí)驗(yàn) 觀察SF 與化療藥物Hom 和Ara-c 的聯(lián)合作用。2mL 培養(yǎng)體系中各組分和不同濃度的SF 均與上述增殖實(shí)驗(yàn)相同，再分別加入終濃度為0.5mg/L Hom 和25mg/L Ara-c，抑制率分別為（22.6±16.0）%和（21.5±9.9）%，以不加SF 和化療藥物為對照組，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中孵育1h，用單IMDM 培養(yǎng)液洗滌1 次，離心棄上清，加入雙IMDM 培養(yǎng)液使成2×106/mL 的細(xì)胞懸液。

將上述不同組合的細(xì)胞均用20%的植物血凝素-白細(xì)胞條件培養(yǎng)基（PHA-LCM）作刺激因子孵育20h，然后加入瓊脂進(jìn)行半固體集落培養(yǎng)，培養(yǎng)體系含20%的馬血清、10%的PHA-LCM 和0.3%的瓊脂，均置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)7天后，計數(shù)白血病集落數(shù)（＞40 個細(xì)胞），并計算各實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%。按化療藥物抑制率＞30%作為對該藥敏感，而＜30%為對該藥不敏感的標(biāo)準(zhǔn)來判斷[8]。

2.5 MTT 法檢測SF 對HL-60 細(xì)胞增殖的影響及其與化療藥物的聯(lián)合作用

2.5.1 抑制實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，SF 終濃度分別為0.5、10、20、40μmol/L，藥物干預(yù)時間為48h，每組設(shè)3 個復(fù)孔。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至5×104個/mL，96 孔板每孔接種100μL后，加入含不同濃度SF 的新鮮培養(yǎng)液80μL 培養(yǎng)48 h，每孔加入20μL MTT 溶液（5g/L，終濃度0.5g/L），細(xì)胞培養(yǎng)箱放置4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀490nm 處測定各孔的吸光度值（A490nm）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。取三個孔的平均值，并計算各實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%。

2.5.2 協(xié)同實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)分四組：空白對照組（不加SF）、SF 組（5μmol/L）、化療藥組和SF 聯(lián)合化療藥組，培養(yǎng)體系除與上述抑制實(shí)驗(yàn)相同外，化療藥組中加入化療藥80μL/孔，SF 聯(lián)合化療藥組中SF 和化療藥各加入40μL/孔，Hom 終濃度為0.025mg/L，抑制率為（20.3±7.1）%；Ara-c 終濃度為0.05mg/L，抑制率為（21.1±5.4）%。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SF 對HL-60 細(xì)胞株集落生長的抑制作用 SF對HL-60 細(xì)胞的集落生長的抑制作用呈濃度依賴性，10μmol/L SF 即顯示輕度的抑制作用，集落數(shù)為（127.5±7.8）個，抑制率為（8.1±3.1）%，和對照組比較，P＜0.05。當(dāng)濃度增加至40μmol/L，其抑制作用更加明顯，集落數(shù)為（36.5±4.2）個，抑制率為（74.1±9.0）%，明顯少于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 SF 對HL-60 細(xì)胞集落的作用（）

表1 SF 對HL-60 細(xì)胞集落的作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.2 SF 聯(lián)合化療藥物對HL-60 的抑制作用 當(dāng)SF與化療藥Hom 合用時，Hom 濃度不變（5μg/L），對HL-60 細(xì)胞的抑制與SF 呈劑量依賴關(guān)系，5μmol/L就可與Hom 起協(xié)同作用，集落數(shù)為（95.9±12.5）個，與單用相同濃度SF 的集落數(shù)（132.1±8.1）個比較，P＜0.05，抑制率從（4.5±1.9）%升至（31.0±2.1）%，顯著抑制HL-60 細(xì)胞集落的生成。隨著SF 濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加至20μmol/L 時，集落數(shù)為（52.3±7.0）個，抑制率為（62.3±5.7）%。當(dāng)不同濃度的SF 與化療藥Ara-c 合用時，對HL-60 細(xì)胞的抑制與SF 也呈劑量依賴關(guān)系。

以上結(jié)果提示SF 能夠增強(qiáng)K562 和HL-60 細(xì)胞對化療藥物的敏感性，見表2～3。

3.3 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)SF 抑制人原代白血病細(xì)胞生長 SF 對人原代白血病細(xì)胞集落（CFU-AML）生長的抑制作用呈濃度依賴性，10μmol/L SF 就顯示輕度的抑制作用，集落數(shù)為（88.5±29.3）個，抑制率為（35.6±14.5）%，與對照組的集落數(shù)（131.1±34.0）個相比較，P＜0.05；當(dāng)濃度增加至40μmol/L，其抑制作用更加明顯，集落數(shù)為（46.9±26.7）個，抑制率為（68.6±22.3）%，明顯少于對照組（P＜0.01），見表4。

表2 SF 協(xié)同Hom 抑制HL-60 集落生成作用（）

表2 SF 協(xié)同Hom 抑制HL-60 集落生成作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表3 SF 協(xié)同Ara-c 抑制HL-60 細(xì)胞集落生成作用（）

表3 SF 協(xié)同Ara-c 抑制HL-60 細(xì)胞集落生成作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表4 SF 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（）

表4 SF 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.4 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)SF 協(xié)同化療藥抑制人原代白血病細(xì)胞生長 當(dāng)SF 濃度為5μmol/L 時，和化療藥Hom 聯(lián)合使用后，人原代白血病細(xì)胞集落（CFU-AML）集落數(shù)為（65.7±26.6）個，抑制率為（50.8±14.4）%，明顯大于單用相同濃度SF 的（127.5±27.1）個和（7.2±3.6）%，P＜0.05。隨著SF 濃度增加，兩藥協(xié)同作用對CFU-AML 的影響越大，當(dāng)SF濃度為40μmol/L 時，集落數(shù)為（2.8±2.6）個，抑制率為（97.4±2.8）%，見表5。

當(dāng)SF 濃度為5μmol/L 時，和化療藥Ara-c 聯(lián)合使用后，CFU-AML 集落數(shù)為（87.3±26.8）個，抑制率為（40.0±8.7）%，明顯大于單用相同濃度SF 的（127.5±27.1）個和（7.2±3.6）%，P＜0.05。隨著SF 濃度增加，兩藥協(xié)同作用對CFU-AML 的影響越大，當(dāng)SF濃度為40μmol/L 時，集落數(shù)為（3.9±3.2）個，抑制率為（96.4±4.2）%，見表6。

表5 SF 協(xié)同Hom 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（） 個

表5 SF 協(xié)同Hom 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（） 個

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表6 SF 協(xié)同Ara-c 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（） 個

表6 SF 協(xié)同Ara-c 對人原代白血病細(xì)胞集落的影響（） 個

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

3.5 MTT 法培養(yǎng)SF 抑制HL-60 細(xì)胞增殖 MTT法檢測到5μmol/L SF 時吸光度值為1.01±0.06，與對照組比較，P＜0.05；40μmol/L SF 顯示明顯的HL-60細(xì)胞生長抑制，吸光度為0.26±0.03，與對照組比較，P＜0.01，見表7。

表7 不同濃度SF 對HL-60 細(xì)胞的作用（）

表7 不同濃度SF 對HL-60 細(xì)胞的作用（）

注：與對照組比較，**P＜0.05，**P＜0.01

3.6 MTT 法檢測SF 與化療藥的協(xié)同作用 以5μmol/L SF 和0.025mg/L 化療藥物Hom 合用，SF 能增強(qiáng)Hom 對HL-60 細(xì)胞的的殺傷作用，吸光度為0.59±0.09，明顯小于空白對照組，抑制率為（59.3±7.6）%，P＜0.01，見表8。

表8 SF 與Hom 對HL-60 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用（）

表8 SF 與Hom 對HL-60 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01

以5μmol/L SF 和0.05mg/L 化療藥物Ara-c 合用，SF 能增強(qiáng)Ara-c 對HL-60 細(xì)胞的的殺傷作用，吸光度為0.51±0.08，明顯小于空白對照組，抑制率為（62.2±8.5）%，P＜0.01，見表9。

表9 SF 與Ara-c 對HL-60 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用（）

表9 SF 與Ara-c 對HL-60 細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01

4 討論

蘿卜硫素又稱萊菔子素，就其化學(xué)成分而言,為異硫代氰酸鹽衍生物，易溶于水，它是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗癌成分。大量實(shí)驗(yàn)證明，蘿卜硫素對食道癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等有很好的防治效果[9-10]。其后也有學(xué)者報道[11]，L-蘿卜硫素對K562 和HL-60 細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，但對于蘿卜硫素增加白血病細(xì)胞對化療藥敏感性尚未有更多研究。

在過去的20 年中，白血病的完全緩解率和總生存率（OS）明顯改善，但化療藥的毒副反應(yīng)和耐藥仍是治療失敗導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。尋找一種既能提高化療效果又安全可行的植物有效成分是現(xiàn)在抗白血病研究的熱點(diǎn)。在本研究中，化療藥濃度保持不變，瓊脂半固體培養(yǎng)和MTT 法均證實(shí)了蘿卜硫素聯(lián)合Hom 和Ara-c 比單用Hom 和Ara-c 對HL-60 白血病細(xì)胞抑制率明顯增加（P＜0.05），而且該實(shí)驗(yàn)使用人原代白血病細(xì)胞，也證實(shí)了此結(jié)果。

有文獻(xiàn)報道[12]，造血生長因子（G-CSF 和GMCSF）與化療藥物具有協(xié)同作用。因?yàn)榘籽〖?xì)胞能表達(dá)G-CSF 和GM-CSF 受體，造血生長因子與之結(jié)合后可促進(jìn)細(xì)胞生長，從而誘導(dǎo)更多的白血病細(xì)胞進(jìn)入周期細(xì)胞，使化療藥物的作用大大增強(qiáng)。臨床上也證實(shí)同時使用造血生長因子（G-CSF 和GM-CSF）與化療藥，對白血病細(xì)胞的殺傷力確實(shí)比較大，治療效果也比較好，比如CAG 方案。因此蘿卜硫素聯(lián)合化療藥能使患者的白血病細(xì)胞對化療藥敏感性增加，可能是通過促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期所致。

本組結(jié)果提示，蘿卜硫素能抑制白血病細(xì)胞增殖，并能增加化療藥Hom 和Ara-c 對白血病細(xì)胞的殺傷作用，具有協(xié)同作用，但是具體機(jī)制尚未研究。總之，蘿卜硫素具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步開展臨床研究。

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