制備可溶性腫瘤壞死因子受體II－脂聯(lián)素球部融合蛋白的兩種細胞培養(yǎng)工藝比較

黃世高，尹玉婷，熊春暉，王彩虹，呂建新，高基民

溫州醫(yī)學院 浙江省模式生物技術與應用重點實驗室，浙江 溫州 325035

生物反應器已廣泛應用于表達大量重組蛋白，用于生產(chǎn)重組蛋白藥物的表達系統(tǒng)通常選用哺乳動物中國倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary，CHO)細胞[1-3]。但目前利用動物細胞表達系統(tǒng)獲得蛋白比較困難，一方面動物細胞表達蛋白量比較低，另一方面國內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞技術及儀器設備尚未十分成熟。類風濕性關節(jié)炎已成為危害人類健康最常見、最難治的疾病之一[4-5]，sTNFRII單體是TNFα的天然拮抗劑[6]，sTNFRII-Fc融合蛋白拮抗 TNFa的能力是相應 sTNFRII單體的50～1 000倍[7-8]，sTNFRII-gAD 是借助脂聯(lián)素[9-11]球部 (Globular domain of adiponectin，gAD)可形成同源三聚體的特性[12]，構建的一種可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白，用于治療與腫瘤壞死因子有關的類風濕性關節(jié)炎等多種疾病。

本研究主要利用已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pAAV2-opti-sTNFRII-gAD并篩選出高表達量的CHO/dhfr?細胞[13]，在生物反應器中經(jīng)過籃式貼壁培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)表達融合蛋白，并比較了兩種工藝途徑生產(chǎn)蛋白的產(chǎn)率，探索細胞在生物反應器中生長的最佳培養(yǎng)方式，進而優(yōu)化一套高密度、高表達、高效率的融合蛋白中試工藝路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、試劑及材料

表達重組人sTNFRII-gAD蛋白的CHO工程細胞株D579-dhfr?由本實驗室構建。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購自GIBCO公司；化學成分限定培養(yǎng)基LK021由北京五加和分子醫(yī)學研究所提供；hTNFR-Fc陽性對照品由復旦張江生物醫(yī)藥公司提供；100 kDa超濾離心管購自Sartorius公司；鼠抗人TNFRII單抗購自Abcam公司；馬抗小鼠 IgG/磷酸酶標記抗體購自中杉金橋公司；BCIP/NBT購Calbiochem公司；葡萄糖監(jiān)測試劑盒購自南京建成生物研究所；攪拌培養(yǎng)瓶購自CHEMICAI GLASS公司。

1.1.2 主要儀器

7.5 L Celligen310生物反應器購自美國 NBS(New Brunswick Scientific)公司；AKTA純化儀購自GE公司；Pellicon切相流超濾系統(tǒng) (包括夾具和膜包)購自Millipore公司；平板濾器 (直徑90 mm)購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

采用10個T75培養(yǎng)瓶同時培養(yǎng)CHO細胞，待細胞長滿時消化細胞，以細胞密度為 3×105～4×105cells/mL接種于攪拌培養(yǎng)瓶，攪拌轉(zhuǎn)速設定為80 r/min，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱攪拌培養(yǎng)。

1.2.2 生物反應器籃式貼壁培養(yǎng)細胞

將細胞密度為 3×105～4×105cells/mL的活種子細胞接種到7.5 L生物反應器，生物反應器圓盤填充床里填充250 g FibraCel載體，用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 d后去除培養(yǎng)基，改加不含血清的LK021培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后收獲上清，反應器操作條件：籃式培養(yǎng)pH (7.08±0.1)，DO為60%空氣飽和度，溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速開始為50 r/min，培養(yǎng)到第2天就換為70 r/min，培養(yǎng)過程中每隔12 h取樣，測定葡萄糖和乳酸鹽濃度。共收獲4 L細胞培養(yǎng)上清，用于蛋白的濃縮純化。

1.2.3 生物反應器全懸浮批式培養(yǎng)細胞

取細胞密度為3×105～ 4×105cells/mL的活種子細胞接種到7.5 L生物反應器進行全懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為4.0 L。反應器操作條件：pH (7.08±0.1)，DO為60%空氣飽和度，溫度為37 ℃。培養(yǎng)過程中每隔約24 h取樣，測定葡萄糖和乳酸鹽濃度。連續(xù)培養(yǎng)7 d，期間以RPC軟件進行數(shù)據(jù)采集，實現(xiàn)計算機在線控制，維持細胞培養(yǎng)條件的穩(wěn)定。

1.2.4 sTNFRII-gAD蛋白的點雜交檢測

取全懸浮批式培養(yǎng)的細胞上清，12 000 r/min離心5 min，點雜交檢測上清中目的蛋白的濃度。

1.2.5 培養(yǎng)上清的濃縮及純化

收集細胞培養(yǎng)上清，離心取上清，再經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾，完成樣品的初步純化。純化后的樣品再經(jīng)過 Pellicon切向流超濾系統(tǒng)濃縮。兩種工藝濃縮后的蛋白經(jīng)陰離子交換柱純化，比較產(chǎn)率。

2 結果

2.1 點雜交檢測生物反應器中 sTNFRII-gAD融合蛋白的持續(xù)表達

從第2天到結束前1天，每天取5 μL細胞上清做點雜交，標準品用 100 mg/mL TNFR-Fc作對照。結果發(fā)現(xiàn)顏色逐天加深，表明CHO細胞在反應器內(nèi)持續(xù)表達 (圖1)。

2.2 制備融合蛋白sTNFRII-gAD-工藝流程

工藝流程見圖2。

2.3 兩種工藝流程生產(chǎn)蛋白情況比較

籃式貼壁培養(yǎng)用4 L的LK021培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白32 mg，純度為95%，而全懸浮批式培養(yǎng)則用同樣培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白30 mg，純度為98%，懸浮批式培養(yǎng)獲得的 sTNFRII-gAD蛋白產(chǎn)量和籃式培養(yǎng)相差不多，但蛋白純度是籃式培養(yǎng)的1.03倍 (表1)。

圖1 蛋白點雜交分析驗證融合蛋白的持續(xù)表達Fig. 1 Continuous expression of sTNFRII-gAD fusion protein analyzed by protein dot blotting with monoclonal antibody against TNFRII. (A)Lanes 1 to 5: positive controls at 5 μL of 100 mg/L TNFR-Fc. (B)Lanes 1 to 5:detection of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatants of CHO cells after the culture of 24 h, 48 h,96 h,144 h and 192 h .

3 討論

動物細胞培養(yǎng)開始于20世紀初。1962年，其規(guī)模開始擴大，利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術產(chǎn)業(yè)的重要部分[14]。

目前利用生物反應器進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)并表達目的蛋白具有許多優(yōu)點：無菌操作，維持溫度和pH、DO值穩(wěn)定，監(jiān)測控制自動化，因此非常適合基因工程細胞的高密度、高表達培養(yǎng)。但不同細胞的培養(yǎng)方式和表達條件不完全相同，需要注意摸索最佳培養(yǎng)條件[15]。我們構建的sTNFR-gAD融合蛋白表達于上清中，因此需要從上清中提取和純化目的蛋白。為了提高蛋白產(chǎn)量并利于下游純化的方便，在生物反應器培養(yǎng)條件下比較了兩種細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)率 (表1)。懸浮培養(yǎng)工藝由于培養(yǎng)過程中不用含血清的培養(yǎng)基過渡，所以收集上清中血清含量少，純化時較易純化，得到的蛋白純度較高。而且培養(yǎng)過程中不用更換培養(yǎng)基，經(jīng)濟方便。

圖2 制備融合蛋白sTNFRII-gAD-工藝流程圖Fig. 2 Schematic diagrams of anchorage-dependent basket (A)and full suspension batch (B)cultures for preparation of sTNFRII-gAD fusion protein.

表1 籃式貼壁培養(yǎng)與全懸浮批式培養(yǎng)的比較Table 1 Comparison between anchorage-dependent basket and full suspension batch cultures for preparation of sTNFRII-gAD fusion protein

本研究利用生物反應器培養(yǎng)含sTNFRII-gAD的CHO工程細胞株表達目的蛋白的工藝在國內(nèi)外未見報道。其原因是因為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pAAV2-optisTNFRII-gAD的CHO/dhfr?工程細胞株是本實驗室保存，并已申請專利[16]，該專利是利用了脂聯(lián)素球部自動形成三聚體的特性與sTNFRII融合基因的策略來獲得sTNFRII-gAD重組蛋白，此雙功能蛋白拮抗 TNFα的活性比二聚體化 sTNFRII-Fc更高，但尚未進入市場。所以此工藝還處于初步探索設計階段?；@式貼壁培養(yǎng)工藝，開始因接種細胞數(shù)量較少，以30 r/min的低速攪拌有利于細胞均勻分布在罐體內(nèi)并有效地吸附在填充床的FibraCel載體上，4～6 h后細胞完全貼壁，此時提高攪拌速度為 70 r/min，細胞密度增多后換LK021培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d。全懸浮批式培養(yǎng)則采用逐漸提高攪拌速度，這樣循序漸進，可以使細胞周圍微環(huán)境中代謝物和營養(yǎng)物質(zhì)在短時間內(nèi)達到平衡。兩種培養(yǎng)工藝下該工程細胞株較理想的培養(yǎng)條件為恒定溫度37 ℃、pH 7.08，pH值在線控制靠CO2和碳酸氫鈉的濃度比來維持穩(wěn)定。

任何動物細胞表達的生物制品，都要經(jīng)歷從獲得生產(chǎn)用的工程細胞株系到建立和完善生產(chǎn)工藝的過程。本實驗的有些部分如細胞在生物反應器中的擴大培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)操作模式，如何加強蛋白三聚體的穩(wěn)定性等，還需要更加細致深入的研究，總之建立一套成熟的 sTNFRII-gAD融合蛋白制備工藝流程尤為重要。

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