酶法制備1-磷酸葡萄糖合成條件的響應(yīng)曲面法優(yōu)化

王曉娟，靳利娥，暢芬芬，閻果蘭

太原理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030024

葡萄糖磷酸酯具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)劑等生物活性，人們已將其作為藥物應(yīng)用于臨床[1-2]。目前合成葡萄糖磷酸酯方法有化學(xué)法[3-7]和生物酶法[8]。其中化學(xué)法存在選擇性低、產(chǎn)物不單一等缺點(diǎn)，而酶的專一性使許多用化學(xué)法需多步合成的反應(yīng)可一步完成。目前對(duì)葡萄糖磷酸酯合成大多以淀粉為原料酶催化合成。但由于淀粉在熱的堿性環(huán)境中易分解，而使得磷?；a(chǎn)物復(fù)雜、純度不高，對(duì)合成條件僅進(jìn)行單因素優(yōu)化[9-10]。響應(yīng)曲面法是以回歸模型作為函數(shù)估算的工具，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件的有效方法[11-13]。為了提高產(chǎn)物的純度，使產(chǎn)物單一，本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為底物，具有選擇性較強(qiáng)的三聚磷酸鈉為磷酰化試劑，馬鈴薯磷酸化酶為催化劑，合成1-磷酸葡萄糖，以產(chǎn)物含量為標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)曲面法優(yōu)化合成條件，獲得最優(yōu)的合成工藝參數(shù)。尋找出了一條可信度高，試劑殘留較少，純度高的葡萄糖磷酸酯合成工藝路線。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)使用試劑均為分析純；馬鈴薯 Solanum tuberosum購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。Bruker Biospin GmbH核磁共振儀 (德國(guó))，UV-9100紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利)。

1.2 方法

1.2.1 制備1-磷酸葡萄糖

磷酸化酶的提?。悍Q150 g預(yù)冷24 h的馬鈴薯，粉碎，勻漿，按照文獻(xiàn)[14]提取磷酸化酶。雙縮脲法測(cè)定其蛋白含量為77.93 mg/mL。

1-磷酸葡萄糖制備過(guò)程：將三聚磷酸鈉和葡萄糖及提取的磷酸化酶混合，調(diào)pH為8，30 ℃～40 ℃反應(yīng)12～24 h煮沸，冷卻，離心棄沉淀；上清液按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行粗制和精制得產(chǎn)物。

反應(yīng)方程式如下：

1.2.2 1-磷酸葡萄糖磷含量的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[14]采用鉬藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以標(biāo)準(zhǔn)磷含量 (μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定1-磷酸葡萄糖的純度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0486X?0.00043；R2=0.99968。磷含量P(%)和產(chǎn)物含量W(%)計(jì)算公式如下：

式中 m1：樣品的磷含量 (μg)，m2：對(duì)照磷含量 (μg)，m：樣品質(zhì)量 (g)，n：稀釋倍數(shù)，0.06607表示每毫升1-磷酸葡萄糖純品磷含量。

1.2.3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)考察單因素影響，選擇了 pH，在此基礎(chǔ)上根據(jù)響應(yīng)面軟件分析提供的模型，設(shè)溫度、物料比 (葡萄糖/三聚磷酸鈉)、時(shí)間三因素分別為自變量X1、X2、X3，產(chǎn)物含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，考察其交互影響，實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Variables and levels of the three-variable,three-level Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)曲面法優(yōu)化制備工藝條件

利用Minitab14軟件[15]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定的各因素條件下產(chǎn)物含量見表2。

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到產(chǎn)物含量在反應(yīng)溫度 (X1)、物料比 (X2)和反應(yīng)時(shí)間 (X3)各因素條件下的二次多項(xiàng)回歸模型為：

對(duì)該模型方程進(jìn)行方差分析，F(xiàn) =33.62＞F0.05(9,2)=10.38，P=0.001＜0.01，R2=0.984，說(shuō)明模型擬合程度良好，可用該模型預(yù)測(cè)制備1-磷酸葡萄糖的工藝條件。Box-Beknhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到各個(gè)因素對(duì)產(chǎn)物含量的交互影響的響應(yīng)曲面圖見圖 1(A∶溫度-時(shí)間，B∶時(shí)間-物料比，C∶溫度-物料比)。

表2 Box-Beknhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental conditions and results of Box-Behnken design

由圖1A可看出，溫度對(duì)產(chǎn)物含量的影響較強(qiáng)，溫度過(guò)高和過(guò)低時(shí)產(chǎn)物含量均較低，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)產(chǎn)物含量最高，與溫度對(duì)產(chǎn)物含量相比，時(shí)間的改變對(duì)產(chǎn)物含量的影響不明顯。當(dāng)物料比在1.35∶1 (mol/mol)，時(shí)間在19 h附近可獲得較高的產(chǎn)物含量 (圖 1B)。當(dāng)溫度為 35 ℃，物料比為 1.35∶1 (mol/mol)附近時(shí)可獲得較高的產(chǎn)物含量 (圖1C)。

利用Minitab14軟件的Response Optimizer優(yōu)化的工藝條件：溫度 35 ℃、時(shí)間 19 h、物料比1.35∶1，在此條件下按照模擬方程計(jì)算出產(chǎn)物含量的預(yù)測(cè)值為69.62%。為驗(yàn)證所得結(jié)果的可靠性，按照上述優(yōu)化條件重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得的平均產(chǎn)物含量為 68.06%，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為2.29%。優(yōu)化的1-磷酸葡萄糖合成工藝參數(shù)和文獻(xiàn)[6]相比，具有使用的溫度低、選擇性強(qiáng)、產(chǎn)物較純、低毒的特點(diǎn)。

2.2 核磁共振波譜

圖2為以氘代水 (純度99.9%)為溶劑，頻率為600.13 MHz，Bruker Biospin GmbH共振儀測(cè)試產(chǎn)物1H NMR圖。由圖2可知，質(zhì)子數(shù)比大約為5∶2∶1∶3，分別為產(chǎn)品糖環(huán)上的5個(gè)H，和3個(gè)羥基的3個(gè)H，C6上的2個(gè)H和羥基的1個(gè)H。結(jié)果與Spectral Database for Organic Compounds數(shù)據(jù)庫(kù)一致，且符合反應(yīng)后的糖環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)上僅有一個(gè)羥基被取代。表明產(chǎn)物單一，合成了1-磷酸葡萄糖。

圖1 各因素對(duì)產(chǎn)物含量的交互影響響應(yīng)曲面圖Fig. 1 Response surface of the effect on product contents about interactive influence. (A)Temperature-Time. (B)Time-Molar ratio. (C)Temperature-Molar ratio.

3 結(jié)論

利用響應(yīng)曲面法對(duì)馬鈴薯磷酸化酶催化合成1-磷酸葡萄糖酯的條件進(jìn)行了優(yōu)化。Minitab軟件對(duì)合成過(guò)程的影響因素進(jìn)行了分析?？疾炝藴囟?、物料比、時(shí)間的交互影響，并對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證。采用核磁共振儀對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。確定了最佳合成條件是：溫度35 ℃，葡萄糖與三聚磷酸鈉物料比為1.35∶1 (mol/mol)，時(shí)間19 h。經(jīng)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)值與方程預(yù)測(cè)值較為接近，因此，響應(yīng)曲面法優(yōu)化1-磷酸葡萄糖的合成工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，純度較高，可達(dá)68.06%。核磁譜圖也反映了產(chǎn)物單一。

圖2 1H NMR譜圖Fig. 2 1H NMR spectra.

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