血栓通粉針（三七總皂苷）對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

蔣媛靜

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

腦缺血再灌注后腦損傷的發(fā)生可能與缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞生存環(huán)境發(fā)生變化，包括興奮性氨基酸、自由基、一氧化氮（NO）、Ca2+等，以及一些誘導(dǎo)凋亡的基因過度表達(dá)有關(guān)。Bcl-2 基因是第一個(gè)確認(rèn)為能對抗細(xì)胞凋亡的基因［1-2］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察血栓通粉針對腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響，對腦缺血再灌注損傷與Bcl-2 蛋白的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康Wistar 大鼠60 只，雌雄不分，體質(zhì)量240～320 g（由廣西中醫(yī)藥研究所提供）。將60只大鼠隨機(jī)分成血栓通大劑量組（A 組）、血栓通小劑量組（B 組）、川芎嗪組（C 組）、模型組（D 組）、假手術(shù)組（E 組）5 組，每組12 只。造模前12 h 禁食。

1.2 藥品與試劑 Bcl-2 抗體、Bcl-2 免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB 顯色試劑盒由北京中山生物技術(shù)研究所購，為Sigma 公司產(chǎn)品。血栓通粉針劑的主要成分為三七總皂苷，由廣西梧州制藥集團(tuán)有限公司提供。川芎嗪注射液，由四川蜀樂藥業(yè)股份有限公司提供。

1.3 造模與給藥 A、B 組術(shù)前3 d 腹腔注射血栓通粉針，分別按10、5 mg/kg 劑量給藥。C 組術(shù)前3 d 腹腔注射川芎嗪注射液，按80 mg/kg 標(biāo)準(zhǔn)給藥，每日1次。D、E 組術(shù)前3 d 給予腹腔注射生理鹽水，每次2 mL。采用改良Longa 線栓法［4］制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）再灌注模型。大鼠水合氯醛麻醉后頸部正中做切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈結(jié)扎遠(yuǎn)端剪一小口，將制備好的5 cm 頭端浸蠟魚線沿頸總動(dòng)脈插入至頸內(nèi)動(dòng)脈，頭端距頸外動(dòng)脈分叉口約2 cm 魚線另一端暴露于縫合后的切口外并做標(biāo)記，2 h 后拔出魚線2 cm，大鼠清醒后行Longa 5 分制神經(jīng)功能評分，1～3 分者入選。剔除造模后煩躁、劇烈跳動(dòng)及經(jīng)解剖證實(shí)為蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠。E 組大鼠僅給予剝離頸內(nèi)動(dòng)脈，不結(jié)扎血管；其余4 組大鼠建立大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）再灌注模型，各組于術(shù)前30 min 各給藥1次，術(shù)后6 h 再給藥1次。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

1.4.1 腦組織切片的制作 各組動(dòng)物于手術(shù)后24 h取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定、取腦備用。在4℃冰箱保存經(jīng)4%多聚甲醛固定6～8 h，然后經(jīng)10%及20%蔗糖梯度脫水后，將固定的標(biāo)本用恒冷冰凍切片機(jī)將視交叉層面切成4 μm 厚的冠狀切片，貼附于涂有APES 膠的載玻片上。

1.4.2 免疫組化染色（SABC 法）腦組織經(jīng)冰凍切片，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，羊血清處理后，加入抗Bcl-2 單抗，4℃過夜，依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG 及試劑SABC 20～37℃20 min，DAB 顯色后常規(guī)復(fù)染、脫水、透明、封片、觀察。光學(xué)顯微鏡選擇大鼠兩側(cè)海馬CA1段的神經(jīng)元，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片高倍鏡下5個(gè)不同的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞占全部神經(jīng)元的百分率，取平均值。用Image Pro Plus 圖像分析儀測量Bcl-2 蛋白表達(dá)的平均光密度值表示Bcl-2 蛋白染色強(qiáng)度。

1.4.3 HE 染色 冰凍切片，Harris 蘇木素液5 min，75%鹽酸乙醇分化30 s，酸化伊紅乙醇1～2 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)，方差齊性分析用F 檢驗(yàn)；組間比較用q 檢驗(yàn)和t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 Bcl-2 免疫組化染色陽性細(xì)胞胞漿染成棕黃色，核染色較淺，多為膠質(zhì)細(xì)胞，可見突起，神經(jīng)元亦可見到胞漿或在核周染成棕黃色。E 組大鼠腦組織海馬區(qū)未見Bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)，A 組和C 組海馬區(qū)可見Bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)染色較深。D 組血栓通小劑量組見少量Bcl-2 表達(dá)。

2.2 Bcl-2 蛋白表達(dá)情況 見表1。缺血再灌注24 h后，D 組大鼠與E 組比較Bcl-2 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目增多（P＜0.05）；與D 組比較，A 組、C 組大鼠Bcl-2 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.01）。與B 組比較，A 組Bcl-2 陽性細(xì)胞增高有顯著性（P＜0.05）。A 組與C 組比較未見明顯差異（P＞0.05）。D 組海馬CA1段Bcl-2蛋白表達(dá)光密度值顯著高于E 組，表明Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著高于E 組（P＜0.05）；與B 組比較，A 組光密度值增高（P＜0.05）。A 組、C 組海馬CA1段Bcl-2 蛋白表達(dá)光密度值高于B 組（P＜0.01），A 組與C 組之間比較無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組缺血再灌注24 h 大腦海馬區(qū)Bcl-2 蛋白表達(dá)率和表達(dá)光密度值（±s）

表1 各組缺血再灌注24 h 大腦海馬區(qū)Bcl-2 蛋白表達(dá)率和表達(dá)光密度值（±s）

與D 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。與B 組比較，▲P＜0.05；與E組比較，#P＜0.01。

2.3 組織形態(tài)學(xué)改變 HE 染色，光鏡下所見×40：E組大腦海馬各區(qū)，未明顯特殊病變，神經(jīng)細(xì)胞未見體積增大、水腫變性、壞死改變。D 組大腦海馬各區(qū)，尤其是CA1區(qū)，見神經(jīng)細(xì)胞腫脹，體積增大，胞漿淡染、疏松，核膜不清、碎裂、溶解，細(xì)胞數(shù)目減少。A 組神經(jīng)細(xì)胞接近正常，胞漿稍疏松、淡染，體積稍大，未見神經(jīng)壞死。B 組神經(jīng)細(xì)胞尚腫脹，體積增大，胞漿淡染，但未見明顯壞死。C 組神經(jīng)細(xì)胞稍腫脹，胞漿淡染，未見明顯神經(jīng)細(xì)胞壞死。

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡（PCD），其具有生理性和選擇性特征機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，在各種信號(hào)刺激下，細(xì)胞通過不同的信息途徑導(dǎo)致其正常代謝方式關(guān)閉，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡代謝途徑，并在嚴(yán)格的基因控制下合成所需的特定蛋自酶［5］，激活內(nèi)源性DNA 內(nèi)切酶完成細(xì)胞自殺過程。研究表明，一些凋亡抑制劑如YVAD-FMK、zDEVD、FMK、zVAD.FMK、CrmA、凋亡抑制蛋白、Bcl-2 家族均可抑制細(xì)胞凋亡，縮小梗死體積，改善腦水腫，延長治療時(shí)間窗。神經(jīng)生長因子的抗凋亡作用也已被確認(rèn)。其中Bcl-2 基因是第一個(gè)確認(rèn)為能對抗細(xì)胞凋亡的基因［1-2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血30 min 再灌注24 h時(shí)存活腦細(xì)胞中有大量Bcl-2 表達(dá)，表達(dá)主要位于缺血周邊區(qū)，缺血中心區(qū)為壞死細(xì)胞?？梢哉J(rèn)為，腦缺血再灌注能促使Bcl-2 表達(dá)，Bcl-2 蛋白參與腦缺血的自我保護(hù)過程。假手術(shù)組Bcl-2 散在微弱表達(dá)，推測是由于手術(shù)創(chuàng)傷刺激引起。血栓通大劑量組海馬區(qū)Bcl-2 表達(dá)高于缺血再灌注組的結(jié)果，表明大劑量血栓通能減少神經(jīng)元的死亡，可保護(hù)Bcl-2 蛋白表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元的凋亡。

血栓通粉針（三七總皂苷）除了促使Bcl-2 大量表達(dá)從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞外，還可能通過以下機(jī)制保護(hù)神經(jīng)元。（1）鈣通道阻斷作用：降低缺血腦組織的總鈣含量，減輕缺血缺氧時(shí)腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+過負(fù)荷［6］。（2）抑制NO 含量：腦缺血再灌注期大量產(chǎn)生的NO 對神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用，高濃度的NO 可抑制線粒體呼吸鏈，使能量衰竭；可介導(dǎo)其他毒性自由基的產(chǎn)生，引起膜損傷；抑制DNA的合成和修復(fù)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡網(wǎng)。三七總皂苷可使腦組織NO 含量降低，而對NOS 活性無顯著影響。表明其抗腦缺血作用與其抑制NO的釋放，減輕NO的神經(jīng)毒性有關(guān)［7］。（3）抗自由基作用：能使血中超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，而丙二醛（MDA）顯著減少，PNS 可以有效地保護(hù)內(nèi)源性SOD 活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有明顯的抗氧自由基作用［8］。（4）減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性［9］。（5）降低興奮性氨基酸的毒性作用［10］。（6）能顯著降低TC，TG，LDLCH、全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容的作用，具有抑制大鼠血栓形成、抗缺血性腦損傷作用［11］。

本實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血時(shí)血栓通粉針（三七總皂苷）能顯著上調(diào)體內(nèi)Bcl-2 表達(dá)，減輕缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷，有望作為一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于腦缺血疾病的治療。

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