一顱鎖骨發(fā)育不全綜合征家族的RUNX2基因分析研究

姜濤 蔣序 張運奎

[摘要] 目的 檢測一個顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（CCD）家系RUNX2基因突變情況。方法 采用先證者查證法，對CCD家系各成員進行全身健康狀況及口腔?？茩z查，拍攝X線片；抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應（PCR）擴增RUNX2基因并測序，將先證者及其父母、姐姐RUNX2基因測序結(jié)果進行Blastn比較分析。結(jié)果 在先證者RUNX2基因的外顯子2上發(fā)現(xiàn)了一個C→T突變，此突變來自母系染色體該基因568位點的基因突變；密碼子CGG→TGG引起RUNX2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位保守的精氨酸變成色氨酸，突變型為c.568C>T。結(jié)論 c.568C>T突變是導致該家系發(fā)病的分子基礎。

[關鍵詞] 顱鎖骨發(fā)育不全綜合征； RUNX2； 基因突變

[中圖分類號] R 781.6 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.019

顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（cleidocranial dyspla-sia，CCD）是一種累及骨骼和牙齒的常染色體顯性遺傳性疾病[1]，具有明顯的家族聚集性，男女發(fā)病率無明顯差別，臨床發(fā)病率約為1：1 000 000。CCD常見的臨床癥狀有囟門閉合延遲或不閉合，顱骨縫增寬，鎖骨鈣化不良、缺失或部分缺失，錐形胸，恥骨聯(lián)合增寬而致骨盆發(fā)育不良，身材矮小等；口腔表現(xiàn)常見上頜骨發(fā)育不足，有多生牙，乳牙滯留，恒牙萌出延遲或埋伏牙等癥狀[2-5]。目前CCD的發(fā)病機制尚不清楚，本研究采用分子生物學的方法對1個顱鎖骨發(fā)育不全家系的患者進行RUNX2基因測序分析研究。

1 材料和方法

1.1 研究對象

CCD家系1個，來自山東省濟南市，家系圖見圖1。先證者，女，29歲，2010年6月因“牙齒不齊，咀嚼困難”到濟南市口腔醫(yī)院修復科就診，要求修復上下牙列缺損。采用先證者查證法，對家系各成員進行全身健康狀況及口腔?？茩z查。查體：先證者反，混合牙列，恒牙僅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滯留，11～15、21～25、31～

35、41～45未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松動Ⅱ度；顱骨和面部比例失調(diào)，頭大面小，前額及頂部突出呈方形，前囟門未閉合，從額部到枕部中線區(qū)有明顯凹陷；面中部發(fā)育不足，凹面型，眶距增寬；上頜骨及顴骨發(fā)育不足，下頜骨發(fā)育相對正常；肩部窄小，胸部呈圓錐形，鎖骨短小，僅在近胸骨處可捫及，雙肩下垂并可在胸前并攏。X線（圖2）檢查：上下頜骨內(nèi)有埋伏牙，滯留乳牙牙根未見明顯吸收，前囟門未閉合，顱縫增寬，并見多塊縫間骨，雙側(cè)肩胛骨較小，呈翼狀，位置下垂，雙側(cè)鎖骨肩峰端部分缺如，恥骨聯(lián)合間隙增寬，骶髂關節(jié)輕度增寬。先證者及其母親的臨床表現(xiàn)和X線特征均符合CCD特征。該家系中3代共15位成員，其中CCD患者2例：先證者及其母親，其母親自述先證者姥姥、姥爺和其兄弟姐妹無類似癥狀。

箭頭所指為先證者，Ⅰ～Ⅳ代表代數(shù)。

圖 1 患者家族譜系圖

Fig 1 The pedigree of the involved family

1.2 基因組DNA提取及測序ⅡⅢ

1.2.1 DNA提取 抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血各2 mL，放入干冰凍存，使用Universal Ge-nomic DNA Extraction Kit試劑盒進行DNA 提取，取 1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增 參照文獻[6]的方法設計7對寡核苷酸引物（表1），然后對RUNX2 基因分別使用TaKaRa LA Taq?、TaKaRa MightyAmp DNA Polymerase?進行套式PCR 擴增，反應體系及方法按照說明書進行。

1.2.3 基因測序及突變位點分析 使用TaKaRa Aga-rose Gel DNA Purification Kit切膠回收目的片段進行測序，測序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并對測序結(jié)果進行Blastn比較分析。

2 結(jié)果

將先證者的RUNX2基因測序結(jié)果進行Blastn比較分析，在Exon 2上發(fā)現(xiàn)了一個C→T突變，實際測序圖譜顯示雙峰結(jié)構(gòu)（C、T）；對于其CCD母親的基因檢測結(jié)果表明，此突變來自母系染色體該基因568位點的基因突變；密碼子CGG→TGG可能引起RUNX2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位（R190W）保守的精氨酸變成色氨酸。該突變型為c.568C>T，CGG>

TGG。先證者的父親、姐姐的測序結(jié)果顯示，在同一位點顯示C的單峰，即與Blastn中健康人的序列相同（圖3）。

3 討論

目前的研究表明，顱鎖骨發(fā)育不全的致病基因是RUNX2，該基因定位于染色體6p21[7-8]，基因的錯意表達、基因插入、缺失或者移碼突變等都是造成顱鎖骨發(fā)育不全綜合征的重要原因[9]。

鎖骨顱骨發(fā)育不全呈常染色體顯性遺傳，有很高的外顯率和不同的表現(xiàn)型，輕癥僅有牙齒異常，嚴重者表現(xiàn)為全身骨質(zhì)受累[2]。本研究家系中母女兩人受累，家系其他成員表型正常，考慮基因突變?yōu)橥话l(fā)性，突發(fā)后呈常染色體顯性遺傳。

鎖骨顱骨發(fā)育不全的致病基因RUNX2是哺乳動物編碼轉(zhuǎn)錄因子PEBP2/CBF異二聚體d亞單位的

3個基因之一，此α亞單位包含了有結(jié)合DNA能力的128個氨基酸殘基，并且這一結(jié)構(gòu)在進化中為保守區(qū)域，與果蠅的runt區(qū)域具有較高的同源性，因而得名[6]。

研究發(fā)現(xiàn)RUNX2基因敲除小鼠模型沒有骨組織和成骨細胞，這表明該轉(zhuǎn)錄因子為成骨細胞分化所必需，其在維持正常的骨骼生長發(fā)育中起著重要的作用[10-11]。RUNX2基因突變存在熱點區(qū)域，該基因外顯子1、2、3、5、7編碼蛋白質(zhì)的3個重要功能域：谷氨酸-丙氨酸富集區(qū)（QA功能域）、runt功能域和脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)（PST功能域）[12-14]。本研究檢測到的R190W突變發(fā)生在RUNX2中，位于runt功能域內(nèi)，這個堿基改變將導致位于runt 結(jié)構(gòu)域中第190 位保守的精氨酸編碼為色氨酸（R190W）。在runt區(qū)域中的精氨酸拉伸物對DNA的結(jié)合有重要作用，因此，這個區(qū)域的破壞可以導致DNA結(jié)合能力的喪失[13]，精氨酸側(cè)鏈是DNA結(jié)合的主要區(qū)域，當被不同的疏水性的色氨酸代替后，干擾了runt區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低了DNA的結(jié)合能力。2001年Berg-witz等[15]首次報道了這個突變位點，本研究結(jié)果則進一步證實了RUNX2中的R190W錯義突變?yōu)镃CD的致病突變，推測R190W（c.568C>T）為一個突變熱點。

典型CCD一般根據(jù)患者的典型面容、咬合關系、X線片檢查以及全身情況即可診斷，X線檢查方法為確診本病的主要手段。由于CCD的X線征象具有特殊性，所以診斷并不困難，關鍵在于是否能想到本病。但對于輕癥特別是僅有牙齒萌出異?；颊叩呐R床診斷較困難，通過檢測RUNX2是否存在突變位點可以輔助診斷CCD。由于本病目前尚無確切有效的治療手段且外顯率高，即使檢測基因發(fā)現(xiàn)有突變位點也并無好的治療方法，因此CCD患者愿意進行抽血基因檢測的比例很少。盡管目前已有80～90個RUNX2不同的突變位點被報道，約500個獨立的CCD患者家族經(jīng)過突變檢測的篩選，但是此疾病致病基因的篩選和驗證分析工作仍遠遠不夠，新基因位點的鑒定將保證進一步的系統(tǒng)突變分析工作的開展，這可以為探討CCD致病機制的分子遺傳學機制打下堅實的基礎。對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CCD患者應進行遺傳咨詢，通過產(chǎn)前診斷及時發(fā)現(xiàn)攜帶有致病基因的胎兒[16]。

目前對CCD并無確切有效的治療方法。對于處于生長發(fā)育期的患者可以采用正畸的方法進行治療，必要時拔除滯留乳牙，減小恒牙萌出的阻力，或者采用牽引的辦法幫助恒牙萌出；對于骨缺損導致的鼻梁塌陷等，可采用整形外科手術的方法進行骨移植，恢復患者的容貌；對于缺失牙齒，可采用種植或活動義齒等修復方法來進行修復?？傊?，對于CCD患者需要多學科聯(lián)合修復治療，長期的臨床效果尚需要進一步觀察。

[參考文獻]

[1] Mundlos S， Otto F， Mundlos C， et al. Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dyspla-sia[J]. Cell， 1997， 89（5）：773-779.

[2] Mundlos S. Cleidocranial dysplasia： clinical and molecu-lar genetics[J]. J Med Genet， 1999， 36（3）：177-182.

[3] Fernandez BA， Siegel-Bartelt J， Herbrick JA， et al. Holo-prosencephaly and cleidocranial dysplasia in a patient due to two position-effect mutations： case report and review of the literature[J]. Clin Genet， 2005， 68（4）：349-359.

[4] 鄧潤智， 唐恩溢， 楊旭東， 等. 顱骨鎖骨發(fā)育不全綜合征的特征分析[J]. 口腔醫(yī)學研究， 2008， 24（1）：70-71.

Deng Runzhi， Tang Enyi， Yang Xudong， et al. Clinical cha-racteristics of cleidocranial dysplasia[J]. J Oral Sci Res， 2008， 24（1）：70-71.

[5] 蔣蘭， 李勇， 賴文莉. 鎖骨顱骨發(fā)育不全綜合征1例[J]. 華西口腔醫(yī)學雜志， 2009， 27（4）：459-460.

Jiang Lan， Li Yong， Lai Wenli. Cleidocranial dysplasia： a

case report[J]. West China J Stomatol， 2009， 27（4）：459-

460.

[6] Quack I， Vonderstrass B， Stock M， et al. Mutation analysis of core binding factor A1 in patients with cleidocranial dys-plasia[J]. Am J Hum Genet， 1999， 65（5）：1268-1278.

[7] Lin WD， Lin SP， Wang CH， et al. RUNX2 mutations in Tai-wanese patients with cleidocranial dysplasia[J]. Genet Mol Biol， 2011， 34（2）：201-204.

[8] Kamamoto M， Machida J， Miyachi H， et al. A novel muta-tion in the C-terminal region of RUNX2/CBFA1 distal to the DNA-binding runt domain in a Japanese patient with cleidocranial dysplasia[J]. Int J Oral Maxillofac Surg， 2011， 40（4）：434-437.

[9] Zhang C， Zheng S， Wang Y， et al. Mutational analysis of RUNX2 gene in Chinese patients with cleidocranial dyspla-sia[J]. Mutagenesis， 2010， 25（6）：589-594.

[10] Komori T， Yagi H， Nomura S， et al. Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts[J]. Cell， 1997， 89（5）：755-

764.

[11] Chung CR， Tsuji K， Nifuji A， et al. Micro-CT evaluation of tooth， calvaria and mechanical stress-induced tooth mo-

vement in adult Runx2/Cbfa1 heterozygous knock-out mice

[J]. J Med Dent Sci， 2004， 51（1）：105-113.

[12] 軒東英， 莊最新， 謝寶儀， 等. 顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征患者的RUNX2基因突變檢測分析[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志， 2009， 25（4）：544-547.

Xuan Dongying， Zhuang Zuixin， Xie Baoyi， et al. Mutations in RUNX2 gene in a Chinese family with cleidocranial dy-splasia（CCD）[J]. J Pract Stomatol， 2009， 25（4）：544-547.

[13] Yoshida T， Kanegane H， Osato M， et al. Functional ana-lysis of RUNX2 mutations in Japanese patients with cleido-cranial dysplasia demonstrates novel genotype-phenotype correlations[J]. Am J Hum Genet， 2002， 71（4）：724-738.

[14] Zhou G， Chen Y， Zhou L， et al. CBFA1 mutation analysis and functional correlation with phenotypic variability in cleidocranial dysplasia[J]. Hum Mol Genet， 1999， 8（12）：2311-

2316.

[15] Bergwitz C， Prochnau A， Mayr B， et al. Identification of novel CBFA1/RUNX2 mutations causing cleidocranial dysplasia[J]. J Inherit Metab Dis， 2001， 24（6）：648-656.

[16] Hermann NV， Hove HD， J?rgensen C， et al. Prenatal 3D ultrasound diagnostics in cleidocranial dysplasia[J]. Fetal Diagn Ther， 2009， 25（1）：36-39.

（本文編輯 李彩）