5?種牙周齦下可疑致病微生物與慢性牙周炎局部不同牙周狀態(tài)間的關(guān)系

周婷　謝紅　岳朝暉

[摘要] 目的 觀察5種齦下微生物檢出水平與慢性牙周炎局部牙周狀態(tài)的關(guān)系。方法 選擇20例慢性牙周炎患者的80個位點(diǎn)及10例牙周健康者的20個位點(diǎn)為觀察位點(diǎn)，采集齦下微生物樣本，記錄牙周探診深度（PD），根據(jù)所測位點(diǎn)的PD進(jìn)行分組。PD≤4 mm為A組，4 mm6 mm為C組，健康對照組為H組。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和DNA探針反雜交技術(shù)半定量檢測各組伴放線菌嗜血菌、牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌的檢出率和檢出水平。結(jié)果 B、C組牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌的檢出率和檢出水平均高于H組，A組牙齦卟啉單胞菌的檢出率和檢出水平也高于H組，C組福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體檢出水平高于B組，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；伴放線菌嗜血菌在各組間的檢出率及檢出水平都無明顯差異。結(jié)論 隨著牙周袋的加深，牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌體的陽性檢出率和檢出水平都有隨之增加的趨勢；牙齦卟啉單胞菌與慢性牙周炎的早期炎癥關(guān)系較為密切，而福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體與中重度慢性牙周炎炎癥位點(diǎn)的嚴(yán)重程度有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 慢性牙周炎； 牙周致病微生物； 聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號] R 739.86 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.018

菌斑是慢性牙周炎的始動因子，其中齦下菌斑與牙周炎癥的關(guān)系最為密切。組成齦下菌斑的微生物種類繁多，不同微生物之間相互作用、相互影響。研究表明，牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、中間普氏菌、伴放線菌嗜血菌和齒垢密螺旋體被認(rèn)為是齦下菌斑中主要的可疑致病微生物，與慢性牙周炎關(guān)系密切[1]。本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和DNA探針反雜交技術(shù)，半定量檢測慢性牙周炎患者和牙周健康患者齦下菌斑中上述5種牙周可疑致病微生物的分布情況，觀察這5種微生物與不同牙周狀態(tài)之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

從貴州省人民醫(yī)院口腔科門診就診患者中隨機(jī)選取20例臨床診斷為慢性牙周炎（根據(jù)Armitage1999年新分類診斷）的患者，男性9例，女性11例，年齡32～57歲。在本科室工作人員和實(shí)習(xí)學(xué)生中選取10例牙周健康者為對照組，其中男性4例，女性6例，年齡21～33歲。所有研究對象至少有20顆天然牙，且每個象限都余留有天然牙；無任何影響牙周炎進(jìn)程的全身性疾病；3個月內(nèi)未接受過牙周治療或1個月內(nèi)未服用過抗生素。受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床檢查、樣本收集及分組

由經(jīng)過牙周專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)生使用Williams探針嚴(yán)格按牙周探診的操作要求對兩組研究對象進(jìn)行全口牙周探診檢查。牙周炎組選擇每個象限牙周探診最深的位點(diǎn)作為檢測位點(diǎn)（共80個），對照組選取A6和D6的近中頰側(cè)位點(diǎn)作為檢測位點(diǎn)（共20個）；記錄所選位點(diǎn)的牙周探診深度（probing depth，PD）。選好位點(diǎn)后，用手工刮治器先去除齦上菌斑及牙石，棉卷隔濕，先后用2根40號無菌紙尖分別插入牙周袋底，各停留20 s取出，放入無菌1.5 mL Eppen-dorf管中，-20 ℃保存，備用。所有研究對象的檢查及取樣均由同一名醫(yī)生完成。根據(jù)PD的不同分組：A組（PD≤4 mm）、B組（4 mm6 mm），以及H組（健康對照組）。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 DNA的提取 利用試劑盒High Pure PCR Tem-plate Preparation Kit（Roche Diagnostics公司，德國）提取DNA，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增樣本DNA 將提取的樣本DNA采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。dNTP和生物素標(biāo)記的引物由microDent?kit（Hain Diagnostik GmbH公司，德國）提供。反應(yīng)體系：5 ?L PCR buffer，5 ?L 25 mmol·L-1 MgCl2，1 ?L Taq酶，35 ?L引物和dNTP的混合物，5 ?L樣本DNA，陰性對照則加入5 ?L無菌雙蒸水。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s；58 ℃ 2 min，10個循環(huán)，變性95 ℃ 25 s，退火53 ℃ 40 s；延伸70 ℃ 40 s，20個循環(huán)；70 ℃ 8 min，1個循環(huán)。

1.3.3 DNA探針反雜交技術(shù)檢測 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用microDent?kit（Hain Diagnostik GmbH公司，德國）進(jìn)行反雜交，將已有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性解鏈，加入雜交液，45 ℃下與已固定有2個陽性對照帶（一個表示PCR正常進(jìn)行，見圖1中AC；另一個表示反雜交正常進(jìn)行，見圖1中CC；2個陽性對照帶在每個樣本的結(jié)果中都必須出現(xiàn)）和5個牙周致病微生物特異DNA探針的硝酸纖維膜孵育30 min，當(dāng)樣本中的牙周致病微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和與之互補(bǔ)的特異DNA探針結(jié)合后，洗滌去除與探針非特異結(jié)合的DNA，然后加入細(xì)菌蛋白—堿性磷酸酶復(fù)合物及其底物，使特異結(jié)合在硝酸纖維膜上的生物素標(biāo)記的牙周致病微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯紫藍(lán)色。微生物半定量檢測結(jié)果如圖1所示：根據(jù)雜交帶上不同位置區(qū)分微生物種類，以染色帶的深淺代表細(xì)菌量的差異。由同一觀察者按+++（與雜交反應(yīng)對照帶一致），++（介于+++與+之間），+（弱顯色），-（未見顯色）4個等級進(jìn)行判定。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。以不同組別的位點(diǎn)為統(tǒng)計對象，微生物檢出率的比較采用卡方檢驗(yàn)或確切概率法；檢出量按+++、++、+、-分為4個等級，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5種微生物的檢出率

5種齦下可疑致病微生物在各組的檢出率如表1所示。伴放線菌嗜血菌的檢出率在慢性牙周炎各組及H組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌B、C組的檢出率均高于H組，其中福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體B、C組檢出率亦高于A組（P<

0.05）。A組只有牙齦卟啉單胞菌的檢出率高于H組（P<0.05）。

2.2 5種齦下微生物的檢出水平

5種齦下微生物在各組間的半定量檢出水平見表2。H組牙齦卟啉單胞菌的檢出位點(diǎn)數(shù)顯著低于牙周炎各組（P<0.05）。H組與A組福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌的檢出位點(diǎn)數(shù)均少于B、C組（P<0.05），而福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體在B、C組間的檢出位點(diǎn)數(shù)也有差異（P<0.05）。4組伴放線菌嗜血菌的檢出水平無明顯差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，除伴放線菌嗜血菌外，其余4種微生物在B組（4 mm

6 mm）都有較高的檢出率，均高于對照組，且都有隨牙周袋的加深而增加的趨勢，說明這4種微生物與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[2-3]。牙齦卟啉單胞菌在A組（PD≤4 mm）的檢出率較對照組高，且高于其余4種微生物在該組的檢出率，提示牙齦卟啉單胞菌在輕度慢性牙周炎的齦下菌斑中較其他4種微生物更具優(yōu)勢。

本研究中，5種微生物在牙周健康組都有一定量的檢出，但檢出率較牙周炎癥位點(diǎn)低。關(guān)于牙周可疑致病菌是否為牙周常駐菌的爭論一直存在，其在牙周健康者或健康位點(diǎn)的檢出率也不盡相同。Wara-aswapati等[2]通過PCR方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)牙周健康者牙齦卟啉單胞菌、伴放線菌嗜血菌、齒垢密螺旋體和福賽斯坦納菌的檢出率分別為45%、6%、10%和0%；van Winkelhoff等[4]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法，以X線片無牙槽骨吸收作為牙周健康的納入標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)在牙周健康者福賽斯坦納菌、中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線菌嗜血菌的檢出率分別為47.9%、69.1%、10.6%和12.8%；而Klein等[5]采用PCR方法在牙周健康者沒有檢出福賽斯坦納菌和牙齦卟啉單胞菌，在牙周炎患者的健康位點(diǎn)也沒有檢出福賽斯坦納菌，牙齦卟啉單胞菌也只在其中1個位點(diǎn)被檢出。馬麗等[6]采用PCR方法檢測2型糖尿病患者齦下菌斑中的福賽斯坦納菌，發(fā)現(xiàn)重度牙周炎的檢出率（67.39%）明顯高于輕度（47.82%）和中度（48.71%）牙周炎，而在牙周健康組未檢出。由此可見，齦下菌斑微生物檢出率的差別主要是由于檢測方法和檢測對象的納入標(biāo)準(zhǔn)不同而產(chǎn)生的。

與微生物的檢出率相比，微生物的檢出量或特定微生物在齦下菌斑中所占的比例與局部牙周炎癥的程度及發(fā)展預(yù)后關(guān)系更為密切[7]。有學(xué)者[8]提出，牙周致病微生物的量要超過宿主的閾值才可能導(dǎo)致牙周炎癥的發(fā)生和發(fā)展。van Winkelhoff等[4]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)，伴放線菌嗜血菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和福賽斯坦納菌的平均檢出量在牙周炎組均高于健康對照組，且牙齦卟啉單胞菌和福賽斯坦納菌在總檢出量中所占比例顯著高于健康對照組。Mineoka等[9]通過定量PCR方法發(fā)現(xiàn)，PD≥

4 mm且探診出血陽性位點(diǎn)的牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體檢出量明顯多于PD<4 mm或探診出血陰性的位點(diǎn)，3種微生物在數(shù)量上有明顯的相關(guān)性。楊禾等[10]也發(fā)現(xiàn)，齦下菌斑中福賽斯坦納菌的數(shù)量與牙周狀況有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，A組只有牙齦卟啉單胞菌的檢出水平與健康對照組有明顯差異，但是隨著牙周袋的加深，B、C組牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌的檢出水平都較對照組高，提示牙齦卟啉單胞菌的出現(xiàn)可能導(dǎo)致局部發(fā)生牙周炎癥，而后三者的出現(xiàn)則促進(jìn)了牙周局部炎癥的發(fā)展。這一結(jié)果印證了其他學(xué)者[11]對齦下菌斑紅色復(fù)合物的描述：牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體三者在齦下菌斑中的關(guān)系密切，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展有重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然B、C組福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體的檢出率無明顯差異，但C組的檢出量明顯高于B組；該結(jié)果提示，相對于陽性檢出率而言，這兩種微生物量的增加更為重要。

綜上所述，牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌在PD>4 mm位點(diǎn)都有較高的檢出率和檢出量，其檢出水平隨著牙周袋的加深而增加；牙齦卟啉單胞菌與早期慢性牙周炎的發(fā)生較為密切，而福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體與中重度慢性牙周炎局部炎癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Socransky SS， Haffajee AD. Periodontal microbial ecology

[J]. Periodontol 2000， 2005， 38：135-187.

[2] Wara-aswapati N， Pitiphat W， Chanchaimongkon L， et al. Red bacterial complex is associated with the severity of chronic periodontitis in a Thai population[J]. Oral Dis， 2009， 15（5）：354-359.

[3] 鄔春蘭， 蔣建群， 雷建強(qiáng). 牙齦卟啉單胞菌和牙垢密螺旋體在不同深度牙周袋內(nèi)的分布[J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志， 2009， 19（7）：376-379.

Wu Chunlan， Jiang Jianqun， Lei Jianqiang. The distribution of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in different depth of periodontal pockets[J]. Chin J Conserv Dent， 2009， 19（7）：376-379.

[4] van Winkelhoff AJ， Loos BG， van der Reijden WA， et al. Porphyromonas gingivalis， Bacteroides forsythus and other putative periodontal pathogens in subjects with and without periodontal destruction[J]. J Clin Periodontol， 2002， 29（11）：

1023-1028.

[5] Klein MI， Gon?alves RB. Detection of Tannerella forsy-thensis（Bacteroides forsythus） and Porphyromonas gingi-valis by polymerase chain reaction in subjects with diffe-rent periodontal status[J]. J Periodontol， 2003， 74（6）：798-

802.

[6] 馬麗， 張建全， 潘亞萍， 等. 福賽斯坦納菌在2型糖尿病患者齦下菌斑中的分布[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 29（1）：

57-61.

Ma Li， Zhang Jianquan， Pan Yaping， et al. Prevalence of Tannerella forsythensis in subgingival plaque of type 2 dia-betic patients[J]. West China J Stomatol， 2011， 29（1）：57-61.

[7] Abiko Y， Sato T， Mayanagi G， et al. Profiling of subgingi-val plaque biofilm microflora from periodontally healthy subjects and from subjects with periodontitis using quanti-tative real-time PCR[J]. J Periodontal Res， 2010， 45（3）：389-

395.

[8] Socransky SS， Haffajee AD. The bacterial etiology of des-tructive periodontal disease： current concepts[J]. J Perio-dontol， 1992， 63（4 Suppl）：322-331.

[9] Mineoka T， Awano S， Rikimaru T， et al. Site-specific deve-lopment of periodontal disease is associated with increased levels of Porphyromonas gingivalis， Treponema denticola， and Tannerella forsythia in subgingival plaque[J]. J Perio-dontol， 2008， 79（4）：670-676.

[10] 楊禾， 孟姝， 趙蕾， 等. 慢性牙周炎齦下菌斑中福賽斯坦納菌的檢測[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 25（5）：454-457.

Yang He， Meng Shu， Zhao Lei， et al. Quantification of Tan-nerella forsythensis in chronic periodontitis patients[J]. West China J Stomatol， 2007， 25（5）：454-457.

[11] Holt SC， Ebersole JL. Porphyromonas gingivalis， Trepone-ma denticola， and Tannerella forsythia： the “red complex”， a prototype polybacterial pathogenic consortium in perio-dontitis[J]. Periodontol 2000， 2005， 38：72-122.

（本文編輯 吳愛華）