鄰近拔牙創(chuàng)植入正畸微種植體骨界面愈合的組織學研究

周陽明等

[摘要] 目的 通過組織形態(tài)學觀察和定量測定，比較拔牙創(chuàng)對種植體—骨界面愈合進程的影響，并對正畸微種植體骨整合的安全范圍進行探討。方法 12只雄性Beagle犬，按不同愈合時間段（1、3、8、12周）隨機分成4組，建立鄰近拔牙創(chuàng)植入正畸微種植體實驗動物模型。在植入微種植體后愈合的第1、3、8、12周處死各組動物，制備含種植釘?shù)挠步M織切片，觀察組織學形態(tài)，并測定微種植體—骨界面骨接觸率（BIC）。結果 實驗組和對照組在植入后第3周開始出現(xiàn)組織學變化的明顯差異：實驗組骨界面骨吸收活躍；對照組骨界面出現(xiàn)新生骨層，周邊存在活躍成骨細胞。對照組在植入后前8周，BIC值隨著時間的增加而增加。實驗組BIC值在植入3周后有所下降，到第8周達到峰值（80.08%），隨后進入平臺期。兩組BIC的差異表現(xiàn)在植入后第3周：實驗組BIC（44.35%）小于對照組（55.46%），二者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論 拔牙創(chuàng)對微種植體周圍骨重建進程會產(chǎn)生影響，早期表現(xiàn)為加重骨吸收，但在隨后的時間里骨形成效應會迅速加強。

[關鍵詞] 拔牙創(chuàng)； 骨整合； 骨接觸率； 骨重建

[中圖分類號] R 783.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.016

骨整合（osseointegration）的定義為：在光學顯微鏡下，高分子、有生命的骨組織直接與種植體表面接觸[1]。種植體—骨界面的骨整合率越高，種植體的穩(wěn)定性就越高[2]。目前在正畸臨床中利用微種植體提供最大支抗已逐漸普及。隨著正畸成年患者的日益增加，齲壞牙齒局限了正畸醫(yī)師拔牙位置的選擇，很多情況下，正畸醫(yī)師不得不在拔牙遠中骨質區(qū)域植入微種植體以整體內(nèi)收前牙。微種植體行使功能時涉及的力學單位包括：移動牙、拔牙創(chuàng)和微種植體。拔牙創(chuàng)骨質結構改建是否會影響牙齒的移動及牙體、牙周健康，是否會影響微種植體作為正畸支抗的穩(wěn)定性是值得探討的問題。研究[3-4]證實，拔牙創(chuàng)和微種植體—骨界面的愈合進程存在相關性，并且受愈合時間的影響[4]。本實驗通過制作帶種植釘?shù)某步M織切片[5]，觀察拔牙創(chuàng)對種植體—骨界面愈合進程的影響；同時采用微種植體—骨界面的骨接觸率（bone implant contact ratio，BIC）來反映骨整合率，定量分析鄰近和不鄰近拔牙創(chuàng)兩種情況下微種植體—骨界面結合的異同。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性Beagle純種犬12只（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體重13～14 kg，年齡18個月，要求第四前磨牙已萌出，牙體、牙列完整，無齲壞及牙周病，咬合關系正常。所有Beagle犬均采用籠中特殊飼養(yǎng)的方法，定時、定量攝食，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗材料和設備

Aarhus microscrew自攻型純鈦微種植釘（Medi-con公司，德國）；氯氨酮、注射用青霉素鈉（河北省石家莊市華北制藥集團有限責任公司）；過氧化苯甲酰、鄰苯二甲酸二丁酯、二甲苯、甲基丙烯酸甲酯（上海昊化化工有限公司），脫鈣液（體積分數(shù)10%的甲醛溶液92 mL+濃硫酸8 mL）；高速渦輪機（CS181型，上海醫(yī)療器械有限公司），Leica 1600型硬組織切片機、常規(guī)輪轉石蠟切片機（Leica公司，德國），光學顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 建立鄰近拔牙創(chuàng)植入微種植體實驗動物模型

1.3.1 實驗分組 12只Beagle犬隨機分為4組，按植入后第1、3、8、12周編號，每組3只動物。實驗組微種植體在每只Beagle犬拔除上下頜第三、四前磨牙后的拔牙區(qū)域（圖1）植入，共96枚，對照組微種植體在每只Beagle犬上下頜第二前磨牙、第一磨牙的非拔牙區(qū)域植入，共96枚。

箭頭所指為實驗組，其余為對照組。

圖 1 拔牙后植入微種植體

Fig 1 Microscrew implantation after extraction

1.3.2 手術過程 Beagle犬手術前30 min肌注阿托品0.1 mg，以氯胺酮（1 mL·kg-1）靜脈注射行全身麻醉后，四肢固定于犬固定床上，繃帶張口固定，消毒鋪巾。含腎上腺素2%利多卡因局部浸潤注射于術區(qū)口腔前庭溝底，以減少術區(qū)出血和保證麻醉深度。高速渦輪機離斷第三、四前磨牙近遠中向牙根，用拔牙鉗拔除近遠中向牙根后，牙槽復位。在Beagle犬口腔植入位置切開黏骨膜，充分暴露頰側骨質，低速引導鉆鉆開皮質骨，使用就位器將微種植體植入到位。微種植體全部植入后拍攝頜骨X線片。術后1～5 d肌肉注射青霉素以預防感染。

1.4 制備含種植釘?shù)挠步M織切片

處死動物后取下帶種植體的下頜骨，修整標本，要求每個組織塊均包含1枚種植釘和其周圍至少4 mm的骨質，無軟組織。將標本置于多聚甲醛液中固定1周后，按照常規(guī)程序進行梯度脫水和組織塊包埋。在硬組織切片機上將組織塊固定，在流水冷卻下對組織塊進行慢速切割，切片方向平行于種植體長軸，切片厚度約50 μm，含種植體的硬組織切片采用甲苯胺藍（toluidine blue，TB）染色。

1.5 組織形態(tài)學觀察

采用計算機圖像分析系統(tǒng)在顯微鏡下觀察界面骨重建過程以及相關細胞的形態(tài)，同樣利用計算機圖像分析系統(tǒng)采集硬組織切片圖像。

1.6 測定微種植體—骨界面BIC

在低倍（放大40倍）鏡下，對硬組織標本的界面骨組織攝像，利用Image Pro-Plus軟件分別對每個圖像的種植體—骨結合界面進行靜態(tài)骨組織形態(tài)測量，根據(jù)下列公式計算BIC[5]：BIC=種植體螺紋與骨接觸部分的長度/種植體螺紋界面的長度×100%。每個硬組織標本取2張切片求其平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理

BIC結果輸入SPSS 10.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

實驗組和對照組植入的微種植體均沒有松動。2組拔牙創(chuàng)的組織學形態(tài)見圖2，微種植體—骨界面骨整合狀態(tài)見圖3。

2.1 組織學觀察

第3周時，拔牙創(chuàng)可觀察到有大量膠原纖維排列成網(wǎng)狀，里面有許多血管樣空洞（圖2左），有網(wǎng)狀骨形成，尚未見骨小梁；第8周時已經(jīng)出現(xiàn)成熟的骨小梁結構，網(wǎng)狀骨逐漸向板狀骨過渡（圖2中）；第12周時，拔牙創(chuàng)內(nèi)骨密度已經(jīng)明顯增加，存在粗大骨小梁，形態(tài)接近正常牙槽骨（圖2右）。

微種植體—骨界面比較：植入后第1周，實驗組和對照組微種植體—骨界面均以大量排列紊亂的肉芽機化組織居多（圖3A、F）；植入后第3周，實驗組和對照組微種植體—骨界面炎癥反應均有所減輕，實驗組以大量結締組織取代肉芽組織，但尚未見新骨形成，血管化現(xiàn)象不明顯，對照組結締組織較實驗組范圍小，有較明顯的血管化現(xiàn)象（圖3B、G、H）；植入后第8周，實驗組和對照組的微種植體—骨界面均可見與種植體直接接觸的網(wǎng)狀骨及少量的成骨細胞（圖3C、I）；植入后第12周，實驗組和對照組微種植體—骨界面出現(xiàn)鈣化的層狀骨，與舊骨密度相近呈束狀排列，致密且規(guī)則，哈弗系統(tǒng)清晰可辨，骨內(nèi)膜處骨結構成熟，高度鈣化（圖3D、E、J）。

2.2 BIC測定結果

實驗組和對照組BIC的測定結果見表1。在各個愈合時期，BIC測量值均大于40%；僅在植入第3周，兩組BIC的差異有統(tǒng)計學意義，對照組高于實驗組（P<0.01）。對照組在植入后前8周的BIC值隨著時間的增加而增加，8周后BIC值沒有變化；實驗組在植入后3周較植入后1周BIC值有所下降，但3周以后迅速升高，到第8周達到峰值（80.08%），隨后進入平臺期至12周。

3 討論

3.1 含種植體的硬組織切片的優(yōu)勢

口腔頜面部組織結構復雜，種植體直接植入骨和軟組織內(nèi)[6]。在對微種植體—骨界面進行研究的過程中，選擇優(yōu)化的切片技術，使之能同時保持各種硬組織原有的結構形態(tài)是非常有用和必須的[7]。含種植釘硬組織切片是一項重要的檢測技術[8]：組織塊經(jīng)包埋后，首先由硬組織切片機切成110～120 μm的切片，然后經(jīng)自動磨片系統(tǒng)打磨成60～100 μm的磨片。與傳統(tǒng)的硬組織切片技術相比，含種植釘?shù)挠步M織切片有其難點。金屬種植釘?shù)挠捕雀哂诠墙M織，不但易損傷鎢鋼刀片，而且不易獲得所需厚度。本研究為了解決這些問題，采用純鈦種植釘。純鈦在金屬中硬度相對較低，而且正畸微種植釘體積較小，直徑多為1.2～2.7 mm，長度多為5～12 mm，這為獲得含種植釘?shù)某步M織切片提供了可能。采用專用硬組織切片機，可使同一標本獲得數(shù)張磨片，有利于觀察和統(tǒng)計；對切片速度和厚度進行適當?shù)目刂?，對微種植體和骨組織進行整體切片，可以直接得到60～80 μm的超硬組織切片。

3.2 微種植體穩(wěn)定性骨組織形態(tài)學定量測定的研究

骨組織形態(tài)學定量測定是一種用定量方法測量分析骨組織形態(tài)動態(tài)變化的技術。植入?yún)^(qū)種植體—骨界面的良好結合，不僅能提供抗位移的良好機械強度，還能分散種植體—骨界面的應力。組織定量分析方法較多，標準也不統(tǒng)一，常用的分析方法包括骨形成率和骨接觸率，此外還包括骨體積比（參考面內(nèi)的骨體積）、編織骨百分比（指定區(qū)域內(nèi)的編織骨比例）、骨厚度（螺紋頂、底的厚度差）以及礦物沉積率（單位時間內(nèi)的礦物沉積厚度）等[9]。骨形成率通過測定骨捕獲腔（bone harvest chambers）或螺紋平面上單位時間內(nèi)的骨生成量來確定[10]。從取自患者身上能穩(wěn)定行使功能的種植體來看，人骨沉積率為60%～85%，也有人認為骨結合即相當于60%以上的骨接觸率以及皮質骨內(nèi)螺紋70%以上的骨充填率[11]。計算骨接觸率有3種方式：1）總骨—金屬接觸面積/總長度，2）皮質骨內(nèi)3個完整連續(xù)螺紋內(nèi)的骨接觸面積/總長度，3）螺紋內(nèi)總骨面積/總長度或螺紋內(nèi)外骨面積/總長度的比值[5]。在本實驗中，通過圖像處理還原低倍鏡下整個種植釘與周圍骨組織接觸的直觀圖像，測量骨與種植體直接接觸的面積占螺紋總長度的比例來計算骨結合率，結果顯示，這種計算方法能夠有效地反映骨界面骨整合情況，組織學表現(xiàn)能夠解釋統(tǒng)計結果，即量化指標和實際觀測是一致的。

種植體—骨界面的骨整合情況受界面骨的鈣化成熟度和結合率影響[11]，它決定著界面的結合強度與種植體的穩(wěn)定性。研究[12]表明，修復用大種植體要求種植體與骨界面間骨整合率達到80%才能穩(wěn)定。由于修復用大種植體所承受的是咬合力，力系復雜，而正畸用微種植體所承受的力為正畸力，力系較單一[7]，并且正畸微種植釘支抗的尺寸也比傳統(tǒng)牙科種植體縮小了近50%，所以正畸用微型種植體對界面骨整合的要求并不像修復大種植體那么嚴格[9，11]。Roberts等[7]認為，種植體完全被新骨包繞并不是推斷種植體支抗臨床成功的組織學標準，10%的骨整合面積已經(jīng)可以達到正畸力負載的要求。在本實驗中，即使在尚處于炎癥反應的第1周植入微種植體，各組的BIC值也均大于40%，遠遠高于Robert所認為的有效標準10%。由于種植體優(yōu)良的初期穩(wěn)定性取決于皮質骨的厚度，Beagle犬的下頜骨皮質骨非常肥厚，而人的頜骨尤其是上頜骨皮質骨比較薄[4]，因此本動物實驗的結論直接轉移至臨床時需要多方權衡，還需進行更深層次的研究探索。

3.3 拔牙創(chuàng)愈合影響界面愈合情況

Beagle犬下頜骨皮質骨肥厚，在顯微鏡下觀察種植釘植入后在皮質骨和松質骨之間的長度比例大概是1∶1[13]。植入后1周，鏡下觀察實驗組和對照組沒有明顯差異，在松質骨界面表現(xiàn)為明顯的炎癥反應，有微小血腫形成。雖然界面的反應以炎癥反應為主，此時的BIC值兩組卻都大于40%，沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能是因為本研究選擇BIC作為衡量界面骨整合的指標，但BIC反映的是骨與種植釘直接接觸的部分，這種接觸并不代表界面有新骨形成。剛剛植入的微種植體，在最初的1周也許并沒有表現(xiàn)出局部骨形成，但即使界面主要以機械嵌合形式存在，這種嵌合在顯微鏡下觀察也是骨與種植釘直接接觸，同時由于Beagle犬下頜皮質骨肥厚，而皮質骨表現(xiàn)嵌合的能力強于松質骨，因此第1周兩組BIC均較高。

植入后第3周，本實驗觀察到對照組新骨形成的速度和范圍都明顯大于實驗組，并且BIC值顯著大于實驗組。這個時期是拔牙創(chuàng)愈合后一個明顯的骨萎縮階段，說明拔牙創(chuàng)愈合過程中造成的局部骨密度下降在第3周左右可以明顯影響微種植體植入后的界面骨重建，這與文獻中報道局部骨密度的下降可以減慢界面骨形成的速度吻合。因為人的頜骨，尤其是上頜骨皮質骨厚度不像Beagle犬下頜那么肥厚，所以這種反應更加明顯，這提示在臨床上對拔牙創(chuàng)附近植入的種植釘在3周內(nèi)應給予高度關注。在隨后的時間里，界面骨重建隨著時間的延長而日臻完善，兩組BIC值沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異。本實驗設計為無載荷愈合，后續(xù)研究應進一步探索正畸力學加載對拔牙創(chuàng)鄰近微種植體穩(wěn)定性的影響，以更加明確地指導臨床實踐。

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（本文編輯 吳愛華）