響應(yīng)面分析法優(yōu)化重組原動(dòng)蛋白2β 誘導(dǎo)條件的研究

張小鋒

響應(yīng)面分析法(RSM)是一種基于響應(yīng)變量與輸入變量關(guān)聯(lián)性研究的函數(shù)關(guān)系，也是一種工藝優(yōu)化的有效方法［1］，目前被廣泛應(yīng)用于食品、生物、化工、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域，并獲得了較好效果［2］。原動(dòng)蛋白2 具有生物節(jié)律傳遞性、神經(jīng)元遷移影響性、促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮等作用。原動(dòng)蛋白2 在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中經(jīng)可變剪接的mRNA 翻譯后加工處理可形成一種衍生蛋白質(zhì)因子，稱為“原動(dòng)蛋白2β(PK2β)”。目前生物學(xué)對(duì)于PK2β 的研究?jī)?nèi)容不多，本研究主要采用RSM 方法對(duì)重組PK2β 的誘導(dǎo)條件及影響因素進(jìn)行研究和探討，為基因生物學(xué)蛋白質(zhì)制備等提供有效依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基配置:10 g/L 胰蛋白胨(Tryptone)，10 g/L 氯化鈉(NaCl)，5 g/L 酵母提取物(Yeast extract)，并利用NaOH 將培養(yǎng)基溶液的pH 值調(diào)整至7.4［3］。溴酚藍(lán)由北京精益精化工有限有責(zé)任公司提供?？捡R斯亮藍(lán)由上海滬宇生物有限公司提供?？敲顾赜伤拇ǚ较蛩帢I(yè)有限責(zé)任公司提供。IPTG 由武漢鴻雨新科技有限公司提供。丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺均選用超級(jí)純純度，由上海生工生物工程有限公司提供。冰醋酸、過(guò)硫酸銨、乙醇等均選用分析純純度，由南京化學(xué)試劑有限公司提供。PK2β 表達(dá)重組菌株E.coli BL21(DE3)由上海浩然生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)方法:LB 培養(yǎng)基30 ml 加入卡那霉素，重組菌株E.coli BL21(DE3)取3 μl 凍存液接種于培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)入220 r/min轉(zhuǎn)速和37℃恒溫條件下的電動(dòng)機(jī)中過(guò)夜。以0.1%的比例將培養(yǎng)后的種子菌液接種于LB 培養(yǎng)基，同樣220 r/min轉(zhuǎn)速和37℃恒溫條件下培養(yǎng)，測(cè)定OD600 達(dá)到設(shè)定值時(shí)，將IPTG 加入種子菌液中，誘導(dǎo)PK2β 表達(dá)重組。

1.2.2 分析軟件:PK2β 表達(dá)量采用光密度掃描法檢測(cè)，采用Quantity one v4.62 生物圖像處理軟件進(jìn)行定量分析，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析采用北京伯樂(lè)生命科學(xué)工作者發(fā)展有限公司提供的Mini-Protean 3 電泳系統(tǒng)。

1.2.3 觀察指標(biāo):采用單因素分析方法。先對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)物濃度進(jìn)行固定，變動(dòng)誘導(dǎo)時(shí)間，分析誘導(dǎo)時(shí)間與PK2β 表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性;再對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度進(jìn)行固定，變動(dòng)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，分析誘導(dǎo)時(shí)機(jī)與PK2β 表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性;最后對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)時(shí)機(jī)進(jìn)行固定，變動(dòng)誘導(dǎo)物濃度，分析誘導(dǎo)物濃度與PK2β 表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)單因素分析結(jié)果對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行關(guān)系優(yōu)化，將三種因素各取3 個(gè)高水平點(diǎn)值，采用回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析。方程表示為［4，5］:

式中，Yi 表示預(yù)測(cè)響應(yīng)值，Xi 表示三大因素的水平值，i=1為誘導(dǎo)時(shí)間，i=2 為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，i=3 為誘導(dǎo)物濃度，βi、βij、β0分別表示線性偏移項(xiàng)、二階偏移項(xiàng)和偏移項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)時(shí)間 固定誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600 為0.6，誘導(dǎo)物濃度為1 mmol/L，變動(dòng)誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為1 ～9 h，每間隔1 h 進(jìn)行1 次測(cè)定和記錄。具體測(cè)定PK2β 表達(dá)量隨著誘時(shí)間的延長(zhǎng)，PK2β表達(dá)量逐漸上升并趨于平緩;其中6 h 時(shí)為峰值，為最佳誘導(dǎo)時(shí)間;4 ～9 h 曲線平穩(wěn)，為最佳誘導(dǎo)時(shí)間段。見(jiàn)圖1。

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間下單因素PK2β 表達(dá)量變化趨勢(shì)圖

2.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)固定誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，誘導(dǎo)物濃度為1 mmol/L，變動(dòng)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600 為0.1 ～0.9，每間隔0.1 進(jìn)行1 次測(cè)定和記錄。具體測(cè)定PK2β 表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的變化，PK2β 表達(dá)量上升至峰值又呈現(xiàn)下降趨勢(shì);其中OD600 為0.4 時(shí)為峰值，為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī);OD600 為0.3 ～0.8 時(shí)，PK2β表達(dá)量相對(duì)較高，為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)下單因素PK2β 表達(dá)量變化趨勢(shì)圖

2.3 誘導(dǎo)物濃度固定誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600 為0.4，變 動(dòng) 誘 導(dǎo) 物 濃 度 設(shè) 置 為0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L。具體測(cè)定PK2β 表達(dá)量隨著誘導(dǎo)物濃度的提升，PK2β 表達(dá)量先上升然后趨于平穩(wěn);0.5 ～5 mmol/L 為最佳誘導(dǎo)物濃度范圍。見(jiàn)圖3。

圖3 不同誘導(dǎo)物濃度下單因素PK2β 表達(dá)量變化趨勢(shì)圖

2.4 響應(yīng)面分析響應(yīng)面分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)時(shí)間為7 h、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600 為0.5、誘導(dǎo)物濃度為0.1 mmol/L 時(shí)，重組PK2β表達(dá)量為最優(yōu)。

3 討論

隨著我國(guó)醫(yī)療事業(yè)的不斷發(fā)展與發(fā)達(dá)，對(duì)疾病的治療與預(yù)防已經(jīng)逐漸深入到生物學(xué)、分子學(xué)領(lǐng)域?；蚬こ逃直环Q為“DNA 重組技術(shù)”，是通過(guò)將不同來(lái)源的基因在體外進(jìn)行重組與拼接而形成雜種DNA 分子，再導(dǎo)入到活細(xì)胞中，從而獲得更加優(yōu)質(zhì)的生物遺傳因子，生產(chǎn)新品種［6，7］?；蚬こ碳夹g(shù)在對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，表達(dá)效果受到載體、宿主菌體、目的基因、誘導(dǎo)條件等影響，而誘導(dǎo)條件主要包括誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)物濃度。

但是，基因工程菌表達(dá)重組蛋白時(shí)可能對(duì)其它蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響和干擾，從而影響細(xì)胞自身代謝能力及細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖能力，因而研究和探討重組蛋白的最佳條件具有重要意義。一方面使菌體個(gè)體呈現(xiàn)良好的生理狀態(tài)，另一方面也使菌群整體處于高密度、高生長(zhǎng)狀態(tài)，從而盡可能高的獲得重組蛋白的表達(dá)。

誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)可以使菌體內(nèi)部積累起更大含量的重組蛋白，然而，當(dāng)積累時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，易對(duì)量產(chǎn)的效率產(chǎn)生影響，而且一些菌體可能因自溶造成重組蛋白的胞內(nèi)損失。在本組研究中我們發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)時(shí)機(jī)與誘導(dǎo)物濃度不變的情況下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，PK2β 表達(dá)量初期上升并逐漸趨于平穩(wěn)，且在6 h 達(dá)到最佳的誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不可過(guò)早或過(guò)晚，過(guò)早可能使菌的總體密度尚未達(dá)到理想值時(shí)即開(kāi)始進(jìn)行蛋白的表達(dá)重組，加大了菌體的代謝負(fù)擔(dān)，影響增殖;而時(shí)機(jī)若過(guò)晚，則菌的個(gè)體生理狀態(tài)達(dá)不到良好效果，從而降低了單位蛋白的表達(dá)重組水平，對(duì)于整體的表達(dá)水平提升產(chǎn)生影響。本組研究中，在誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度不變的情況下，隨著誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的發(fā)展，PK2β 表達(dá)量逐步上升至峰值，再逐漸下降，而OD600 為0.3 ～0.8時(shí)，PK2β 表達(dá)量相對(duì)較高，為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。誘導(dǎo)物濃度的高低影響了其誘導(dǎo)效率，用量不足，無(wú)法發(fā)揮對(duì)蛋白表達(dá)重組的啟動(dòng)作用，影響蛋白水平的高表達(dá);而用量過(guò)高則引起過(guò)度表達(dá)而影響整體密度，也達(dá)不到較好的重組蛋白表達(dá)水平。本組研究中，在誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不變的情況下，隨著誘導(dǎo)物濃度的增加，PK2β 表達(dá)量快速上升后趨于平穩(wěn)，而0.5～5 mmol/L 為最佳誘導(dǎo)物濃度范圍。

當(dāng)然，為了進(jìn)一步了解三種因素的相關(guān)性，以便于在實(shí)踐過(guò)程中通過(guò)三種誘導(dǎo)條件的有效配比來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳的PK2β 表達(dá)量，本組研究還采用了RSM，利用回歸方程將誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)物濃度結(jié)合起來(lái)［8］，最終獲得結(jié)論:誘導(dǎo)時(shí)間為7 h、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600 為0.5、誘導(dǎo)物濃度為0.1 mmol/L時(shí)，重組PK2β 表達(dá)量為最優(yōu)。

1 魏娜，羅敏，曾一梅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化重組工程菌的發(fā)酵工藝條件.生物技術(shù)，2010，20:69-72.

2 Choi J，Lee PC，Kim JH，et al.FM-P33 Medium optimization for the production of astaxanthin by paracoccussp using response surface methodology.J Biosci Bioeng，2009，108(Suppl 1):129-132.

3 陳魁主編.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析.第5 版.北京:清華大學(xué)出版社，2008.94-98.

4 劉斌，郭紅麗，鈕小松，等.基因重組酵母工程菌優(yōu)化表達(dá)人源泉膠原蛋白.南京理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35:558-560.

5 杜少平，梁淑娃，楊冠東，等.響應(yīng)面法優(yōu)化兩歧雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基.生物技術(shù)通報(bào)，2008，24 增刊:431-435.

6 苗猛猛，王旭靜，唐巧玲，等.抗蚜基因工程研究進(jìn)展.生物技術(shù)進(jìn)展，2012，2:104-108.

7 蓋樹(shù)鵬.基因工程實(shí)踐教學(xué)改革的探索.科技信息，2012，5:18-20.

8 熊春紅，彭康年，謝明勇.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取原子熒光法快速測(cè)定茶葉痕量汞.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31:2843-2846.