多光子發(fā)光的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒在生物光子學(xué)中的研究進(jìn)展＊

詹求強，劉 靜，趙宇翔，張 欣

(華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院光及電磁波研究中心，廣東廣州 510006)

0 前言

隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，光學(xué)生物成像技術(shù)在其中發(fā)揮的作用越來越重要，而熒光成像因為其高分辨率、靈敏、快速的特點得到了非常廣泛的研究和應(yīng)用。目前的熒光標(biāo)記物主要是有機染料熒光團(tuán)、量子點(quantum dot，QD)、金屬納米顆粒、上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNPs)、碳納米顆粒等。這其中，有機染料熒光團(tuán)使用的最早也最廣泛，但其光穩(wěn)定性差，不能長時間連續(xù)觀察，且吸收和發(fā)光譜線寬;半導(dǎo)體量子點光穩(wěn)定性好，輻射譜線窄，但其可能存在的生物毒性和化學(xué)不穩(wěn)定性使其不能進(jìn)一步在生物熒光成像領(lǐng)域得到應(yīng)用。

UCNPs作為一種近期快速發(fā)展的熱門熒光標(biāo)記物，在某些方面比有機染料熒光團(tuán)和量子點有明顯的優(yōu)勢。圖1給出了UCNPs和QD這兩種材料在生物應(yīng)用上論文數(shù)量的比較，兩條曲線有著相似的走向，可以看出UCNPs的熱門程度不亞于QD，上轉(zhuǎn)換文章數(shù)量的快速增長正說明了這一材料的巨大潛力。UCNPs主要指摻雜了稀土(rare earth，RE)元素后能夠受兩個或多個低頻光子激發(fā)而輻射出一個高頻光子的納米級大小的粒子，它具有光穩(wěn)定性高、發(fā)射光譜譜線窄、熒光壽命長、化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點。而且上轉(zhuǎn)換材料可以完全消除自發(fā)的背景熒光，能獲得超高的成像對比度。同時，由于是多光子發(fā)光過程，它還有著非常好的成像分辨率。在近紅外光(near infrared，NIR)激發(fā)下UCNPs可發(fā)射出近紅外光，具有較好的光學(xué)穿透深度，并且對生物組織也幾乎沒有損傷。以上這些優(yōu)勢都使UCNPs在生物光子學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用可能。

1 光學(xué)特性

1.1 UCNPs的激發(fā)、熒光光譜及發(fā)光原理

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是一種在納米晶體基質(zhì)中摻雜RE離子(以Er3+，Tm3+，Ho3+和Yb3+為主)的復(fù)合納米材料，RE離子普遍具有多能級結(jié)構(gòu)(圖2)，在這幾種RE離子中，Yb3+充當(dāng)敏化離子(sensitizer)角色，而其他的RE離子充當(dāng)活化離子(activator)角色。整個上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程包括敏化離子-活化離子之間的能量傳遞、敏化離子-敏化離子和激活離子-激活離子之間的能量轉(zhuǎn)移(圖2)。在這些能量轉(zhuǎn)移過程中會有雙光子和三光子過程，分別激發(fā)出綠光、紅光和藍(lán)光。上轉(zhuǎn)換的發(fā)光波長幾乎覆蓋了紫外、可見、以及紅外光區(qū)的光譜范圍［1，2］。

圖1 近年來發(fā)表有關(guān)QD和UCNPs在生物應(yīng)用研究中的論文數(shù)量比較Fig.1 A quantitative comparison of research activity in bio-applications of QD and UCNPs，measured as number of research articles per year

關(guān)于多種RE離子間能量轉(zhuǎn)移傳遞上轉(zhuǎn)換發(fā)光的過程機制，可以分為激發(fā)態(tài)吸收(excited state absorption，ESA)、能量傳遞上轉(zhuǎn)換(energy transfer upconversion，ETU)、交叉弛豫(cross relaxation，CR)、合作敏化上轉(zhuǎn)換(cooperative sensitization upconversion，CSU)和光子雪崩(photon avalanche，PA)等五種［2-4］。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的發(fā)光機制主要是基于能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程，其他幾個能量傳遞過程也存在，但發(fā)生幾率很小。

圖2 敏化離子Yb3+與活化離子Er3+，Tm3+的能級結(jié)構(gòu)以及他們之間通過能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程的能級躍遷機制2Fig.2 Energy level structure and proposed UC mechanisms of the Yb3+，Er3+/Tm3+co-doped UCNPs

圖3 三種不同UCNPs:NaYbF4:Yb3+/Ho3+(綠)，NaFbF4:Yb3+/Er3+(紅)，NaFbF4:Yb3+/Tm3+(藍(lán))的發(fā)光光譜和發(fā)光照片5Fig.3 Photoluminescence spectra of NaYbF4:Yb3+/Er3+(red emission)，NaYbF4:Yb3+/Ho3+(green emission)，and NaYbF4:Yb3+/Tm3+(blue emission).The insets show the visible photoluminescence imaging of the UCNP colloidal suspension

1.2 UCNPs光學(xué)性質(zhì)

與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物不同，UCNPs可以用近紅外光激發(fā)而不是紫外光，從而明顯的減小了生物樣品的光致?lián)p傷，同時增大了激發(fā)光的穿透深度。這種上轉(zhuǎn)換激發(fā)所采用的反斯托克斯機制可以去除自發(fā)熒光進(jìn)行探測，從而帶來非常好的信噪比并且改善探測器的靈敏度。同時上轉(zhuǎn)換過程存在真實的直接能級，相比普通的雙光子發(fā)光現(xiàn)象有著更高的效率，在低功率密度照射下可以產(chǎn)生生物研究中所需要的穩(wěn)定適中的光強。UCNPs可以用小巧、廉價、低功率的近紅外激光器激發(fā)，重要的是在連續(xù)照射下不會產(chǎn)生閃爍、光漂白和光化學(xué)降解［6-8］。UCNPs的另一個優(yōu)勢是它包含窄而清晰的發(fā)射峰(半高線寬，F(xiàn)WHM＜12 nm)，具有較長的熒光壽命(μs～ ms)［9，10］。

2 UCNPs的化學(xué)合成及修飾方法

2.1 UCNPs的組成材料

上轉(zhuǎn)換納米粒子一般由無機主基質(zhì)和摻雜在主基質(zhì)晶格中的鑭系離子組成，具體可參考圖5，摻雜的離子又分為敏化劑和活化劑。

研究上轉(zhuǎn)換所用到的主基質(zhì)很多，理想的主基質(zhì)有低的晶格聲子能量，這樣將使非輻射損失最小化，同時主基質(zhì)的晶格也要和摻雜離子相匹配以達(dá)到最好的摻雜效果。本文主要介紹的主基質(zhì)為NaYF4。

圖4 UCNPs沒有光致漂白和光閃爍現(xiàn)象:(a)單UCNPs在長時間探測后有光穩(wěn)定性;(b)UCNPs的時間分辨輻射;(c)分別用405，543和980 nm連續(xù)激光在1.6，0.13和19 mW下同時激發(fā)得到的焦面成像［6-8］Fig.4 Nonbleaching and nonblinking behavior of UCNPs:(a)Photostability of a single UCNP under longtime monitoring;(b)Time-resolved emission of UCNP，suggesting no on/off behavior;(c)Simultaneous excitations was provided by CW lasers at 405，543，and 980 nm with powers of approximately 1.6，0.13，and 19 mW in the focal plane，respectively

理論上大部分的RE離子都可以進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)射，但在低強度激發(fā)功率下，只有少數(shù)的RE離子可以進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)射，如Er3+，Ho3+和Tm3+用來做為活化劑。它們有著階梯狀的能級結(jié)構(gòu)，可以被近紅外光激發(fā)產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光。活化劑的含量都相對較低(一般＜2 mol%)，這樣以減小交叉弛豫的能量損失。

為了提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率并且使其在在近紅外區(qū)有足夠大的吸收截面，通常我們還需要一個敏化劑和活化劑共同摻雜。Yb3+相比于其他的鑭系元素離子，在900-1000 nm附近有一個較大的吸收截面，它作為敏化劑經(jīng)常與Er3+，Ho3+和Tm3+共同摻雜來提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率(圖2)。

2.2 合成方法

合適的尺寸和均一的形狀是上轉(zhuǎn)換納米粒子應(yīng)用于生物成像的前提。目前為止，有報道過多種合成高質(zhì)量UCNPs的方法，包括有共沉淀法［12］、水熱合成法［13］、熱分解法5、溶膠-凝膠法以及微乳液的合成方法。而在這些方法中，水熱合成法和熱分解法是最為常用來合成均一的、疏水性的納米粒子的方法。本綜述也主要介紹這兩個方法。

圖5 圖示為晶體主基質(zhì)和包含有鑭系離子的上轉(zhuǎn)換納米粒子示意圖(藍(lán)色及白色為主基質(zhì)分子，紅色為摻雜的離子)11Fig.5 Schematic illustration of UC nanoparticles composed of a crystalline host and lanthanide dopant ions embedded in the host lattice

2.2.1 水熱合成法 用水熱合成法合成上轉(zhuǎn)換納米粒子可以很好的控制納米粒子的大小和形狀，反應(yīng)是在密閉的高溫高壓環(huán)境中進(jìn)行的(如圖6)。一般在溶液中混合RE元素前驅(qū)體和氟化物前驅(qū)體，然后密閉在高壓容器中加熱反應(yīng)。經(jīng)常用到的RE元素前驅(qū)體為硝酸鹽、氯化物和氧化物，而較典型的氟化物前驅(qū)體為HF，NH4F，NaF和 NH4HF2，乙二胺四乙酸(EDTA)、溴化十六烷基三甲基銨硝酸鹽(CTAB)、油酸(OA)和檸檬酸三鈉鹽(TSC)為經(jīng)常用到的表面活性劑。Li［13-16］等人報道了一種簡單的相轉(zhuǎn)變及分離的方法(LSS)，用這種LSS方法成功合成了不同主基質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)、大小和形狀的納米粒子，如，BaY2F8，Ba2YF7，Ba2YbF7。Zhang［20］等人報道了一種新穎的容易使用的水熱合成法合成純的六方晶型NaYF4:Yb，Er/Tm納米粒子，此方法合成的納米粒子形狀可控而且上轉(zhuǎn)換發(fā)光強。

2.2.2 熱分解法 在熱分解過程中，三氟乙酸鹽被用作前驅(qū)體來分解得到相應(yīng)的金屬氟化物。Yan［21，22］等人創(chuàng)新性地提出了用 OA/OM/1-十八烯(ODE)與三氟乙酸鹽共熱的方法，以達(dá)到熱分解法需要的高溫(300℃)，并在反應(yīng)中調(diào)節(jié)前驅(qū)體的比例、反應(yīng)的溫度和時間、協(xié)調(diào)溶劑的屬性，來控制納米晶體的相、形態(tài)、大小，從而提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率。但在熱反應(yīng)的過程中不可避免地會產(chǎn)生一些有毒的副產(chǎn)物，如三氟乙酸醋酸酐(CF3CO)2O，三氟乙酰氟CF3CF2COF，羰基二氟化物 COF2和四氟乙烯C2F4，Wei［23］等人報道了一個更好的熱分解方法，通過RE-油酸鹽和NaF混合作為前驅(qū)體進(jìn)行熱分解得到α-和β-NaYF4UCNPs。Chow［24］等人提出油胺(OM)是唯一能使UCNPs從四方晶型轉(zhuǎn)變?yōu)榱骄偷娜軇珻ohen［25］等人用以上控制條件及晶相的方法合成了低于10 nm的六方晶型的UCNPs。

圖6 UCNPs水熱合成法的步驟示意圖Fig.6 The schematic diagram of hydro(solvo)thermal method of UCNPs

2.3 UCNPs的表面修飾

通過以上方法合成的UCNPs一般為疏水性的，而要用于標(biāo)記生物發(fā)光，則需要通過表面修飾使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性的。到目前為止報道的方法很多，主要有配體交換、配體去除、靜電層層自裝法、配體氧化法、層層疊加法、聚合物包覆法、硅烷化及主客體相互作用法(表1)。

3 UCNPs發(fā)光效率優(yōu)化

3.1 材料合成優(yōu)化

對于上轉(zhuǎn)換材料而言，設(shè)計一個符合要求的晶體結(jié)構(gòu)是提高發(fā)光效率的關(guān)鍵性因素，這就需要考慮如何控制材料的晶相、粒度及離子摻雜等因素。

3.1.1 主基質(zhì)優(yōu)化 在熱分解和水熱法合成過程中，立方相的NaYF4首先形成，當(dāng)能量達(dá)到一定值時，就能克服晶體相變所需的自由能，立方相就能向六方相轉(zhuǎn)變［22，25］。(1)延長時間有助于克服立方相的 NaYF4向六方相轉(zhuǎn)變的自由能［22，52］。如圖 7 所示，在我們的試驗中，Gd3+摻雜的NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+納米顆粒半小時后顆粒呈不規(guī)則球狀，一小時后樣品呈非常規(guī)則的的六方相。(2)調(diào)控Na+、RE3+及Y-之間的摩爾比例。在大多數(shù)情況下，六方相的NaYF4不如立方相的NaYF4穩(wěn)定，采用高的 Na+/RE3+和 F-/RE3+比例有利于六方相的NaYF4形成［22，53-55］。(3)配體調(diào)制相變。油胺可以調(diào)制NaYF4的晶相由立方相向六方相轉(zhuǎn)變［24，25］。

表1 UCNPs的表面修飾方法Tab.1 Methods of surface functionalization of hydrophobic UCNPs

圖7 利用溶膠-凝膠法分別烘烤(a)半小時、(b)1小時后得到的NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+的透射電鏡圖Fig.7 TEM images of using sol-gel method after baking NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+for(a)0.5 h，(b)1 h

UCNPs的粒徑越小，比表面積就越大，意味著更多的缺陷和配體將存在于表面，會降低上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率。同時，由于顆粒大小會極大影響生物組織對顆粒的吸收及在生物組織中的分布，因此上轉(zhuǎn)換納米材料顆粒不能太大，否則就不適用于生物成像，故合成足夠小的納米顆粒的同時保持足夠的發(fā)光亮度是我們面臨的一個挑戰(zhàn)。研究者們通過改變表面活性劑(油酸和油胺)的濃度、Y3+/F-比例以及反應(yīng)溫度來調(diào)控合成直徑從4.5 nm到15 nm大小的蛋白質(zhì)尺寸的六方相NaYF4［25］，成功合成了小顆粒高亮度的UCNPs，這一進(jìn)展會拓展和深化UCNPs的生物應(yīng)用，特別是單分子成像中。

3.1.2 離子摻雜優(yōu)化 如圖8所示，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光效率和摻雜RE離子的種類、RE離子間的摩爾比例有很大關(guān)系，發(fā)光強度最大的為Y3+:Yb3+:Tm3+(Er3+)=78:20:2。Li+摻雜到氧化物或氟化物上轉(zhuǎn)換納米材料中能增強上轉(zhuǎn)換發(fā)光［56-61］，Ho3+摻雜離子能增強Tm3+的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光［62］。

3.1.3 表面包覆保護(hù)殼層優(yōu)化 在上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料表面包覆上保護(hù)殼層，可以減少晶體缺陷、保護(hù)光學(xué)活性的離子，從而減少非輻射能量損失［63］。比較無殼層的BaGdF5:Yb3+/Er3+和包覆了活性殼層的BaGdF5:Yb3+/Er3+發(fā)光強度，發(fā)現(xiàn)包覆了活性殼層的納米顆粒的發(fā)光強度較之無殼的有幾百倍的增加［64］。此外，將摻雜離子用一種層狀結(jié)構(gòu)隔離，能抑制焠滅效應(yīng)，有望使上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率得到增強［44，65，66］。

圖8 水熱法合成的5個不同樣品的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜及其對應(yīng)的圓薄片樣品圖Fig.8 Hydro(solvo)thermal method synthesis of 5 different samples of upconversion luminescence spectrum and its corresponding circular wafer sample diagram

3.2 表面等離子對輻射增強

眾所周知，金屬結(jié)構(gòu)獨特的表面等離子特性可以用來增強來自臨近熒光團(tuán)(有機染料和無機量子點)的熒光［67，68］。同樣的，強局部場下的表面等離子共振也能用來增強上轉(zhuǎn)換輻射效率。Zhang［69］等人和Sudheendra［70］等人成功的將納米金顆粒吸附在UCNPs表面實現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換輻射調(diào)制［71，72］。一種特制980 nm輻射金等離子表面對能明顯增強來自納米線層的從近紅外到可見光的上轉(zhuǎn)換發(fā)光［73］。對于有摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金屬納米顆粒的優(yōu)化設(shè)計來說，單納米顆粒表面等離子增強機理的研究是很重要的。然而，使用金屬納米顆粒增強上轉(zhuǎn)換輻射進(jìn)行生物探測仍面臨很大的挑戰(zhàn)，如復(fù)雜的實驗過程和苛刻的實驗條件。

目前利用表面等離子對輻射的金屬增強上轉(zhuǎn)換主要集中在玻璃復(fù)合材料和薄膜上，科學(xué)家們將銀或金的納米顆粒附著在UCNPs上可以增強上轉(zhuǎn)換強度。Yan［74］等人第一次通過一種直接集合的方法將六方形NaYF4:Yb，Er納米顆粒和銀納米線配對觀察到了增強的上轉(zhuǎn)換輻射。紅光輻射(650 nm)比綠光輻射(550 nm)增強因數(shù)更大，并且可以使用聚集了銀顆粒的銀島得到進(jìn)一步的增強。Schietinger［75］等人用一個光學(xué)和原子力顯微鏡相結(jié)合的設(shè)備觀察并控制單 NaYF4:Yb，Er納米顆粒與金納米球(60 nm)的距離，發(fā)現(xiàn)綠光輻射的增強是4.8，而紅光輻射下是2.7。Kennedy［72］等人發(fā)現(xiàn)了一種新型的光子材料，它是一種有非定型金殼層(4-8 nm)的立方NaYF4:Yb，Er/Tm納米晶體。在這種有等離子金殼層的NaYF4:Yb，Tm納米顆粒下觀察到的從近紅外到可見光的上轉(zhuǎn)換增強達(dá)到了8。Duan［71］等人通過六方形NaYF4:Yb，Tm和金納米顆粒的等離子接觸調(diào)制了上轉(zhuǎn)換輻射，并且在452-476 nm的范圍內(nèi)得到了超過150%的輻射強度增強，而647 nm處只有50%左右的增強。最近，Qin［76］等人通過將金納米顆粒(10 nm)吸附在NaYF4:Yb，Tm表面，觀察到對于這種納米復(fù)合材料上轉(zhuǎn)換輻射在波長291 nm和345 nm分別增強了73.7和109.0。

3.3 波長優(yōu)化

在它的所有應(yīng)用中，激發(fā)光都是采用的975 nm附近(如980 nm)的連續(xù)激光，但生物體內(nèi)的主要成分--水在這個波長附近吸收非常的強，這樣就降低了成像深度并造成了明顯的熱效應(yīng)［77］。因此，對于上轉(zhuǎn)換效率在波長方面的優(yōu)化也有它的必要性，2011年 Zhan［27］等人在國際上首次提出了915 nm光作為上轉(zhuǎn)換材料的新激發(fā)光源波長，在生物成像中具有更深的成像深度和更低的熱損傷。使用同樣強度的500 mWcm-2的915 nm和980 nm連續(xù)脈沖激光照射3 min后，溫度分別達(dá)到32.2℃和45℃。

圖9 優(yōu)化上轉(zhuǎn)換成像中的激發(fā)模式實現(xiàn)低熱無損、深度組織成像Fig.9 The optimization of conversion imaging excitation mode to realize low thermal condition，depth tissue imaging

4 UCNPs的生物應(yīng)用

UCNPs生物成像由于具有無自發(fā)熒光、大的反斯托克斯位移、窄的發(fā)射峰、高耐光漂白、無光閃爍、探測深度大以及高的空間分辨率等優(yōu)良的光學(xué)特性，因此近幾年來很多人致力于UCNPs的生物光子學(xué)應(yīng)用。目前在細(xì)胞成像、動物成像、生物傳感、漫射光成像、光動力治療(PDT)、多模式成像(MRI/PET)等方面有眾多應(yīng)用。

圖10 UCNPs的生物應(yīng)用Fig.10 The biological application of UCNPs

4.1 細(xì)胞成像

近幾年來，隨著上轉(zhuǎn)換納米粒子性能的改進(jìn)，基于UCNPs的顯微技術(shù)被廣泛應(yīng)用于高分辨和高對比的離體細(xì)胞的成像。

在無抗體標(biāo)記的細(xì)胞中，用UCNPs吸附在細(xì)胞膜上或被細(xì)胞內(nèi)吞來進(jìn)行成像。最近，Jin［78］等人制備了三種類型的聚合物包覆的UCNPs，發(fā)現(xiàn)了相比于中性和帶負(fù)電荷的聚合物，用帶正電荷的PEI包覆的UCNPs可以增強細(xì)胞對UCNPs的攝取能力。2008年 Nyk［79］等人成功將 MSA-UCNPs應(yīng)用到標(biāo)記Panc 1細(xì)胞進(jìn)行高對比成像(圖11)。

相比于無抗體標(biāo)記的細(xì)胞成像，有抗體標(biāo)記的成像會有更多優(yōu)點，尤其是在腫瘤細(xì)胞靶向成像中有更廣泛的應(yīng)用。表面功能化的UCNPs通過生物分子識別與癌細(xì)胞特異性相結(jié)合，2009年 Wang［80］等人提出用anti-CEA8于UCNPs結(jié)合來進(jìn)行細(xì)胞成像(圖12)。Zhan［27］等人最近報道了一系列對比可控實驗，說明了將NaYF4:Yb3+/Er(Ho)3+與anti-CEA8的抗體相結(jié)合，可以特異性地與Hela癌細(xì)胞膜結(jié)合，從而進(jìn)行成像。

4.2 動物成像

UCNPs的快速發(fā)展使得其實現(xiàn)了在活體中的成像，在早期的研究中，包括皮下注射和UCNPs在生物中的分布成像。Salthouse等［81］人研究了在老鼠的尾巴靜脈注射UCNPs后的積累，結(jié)果表明PEG-UCNPs沒有首先靶向積累在小鼠的肝、脾等處，另外長時間觀察發(fā)現(xiàn)在活體樣品中注射UCNPs 7天后，還可以觀察到體內(nèi)有其存在。

圖11 用UCNPs處理的Panc1細(xì)胞的透射成像(左)和光致發(fā)光成像(右)。插圖為局部細(xì)胞(紅色)和背景(黑色)的光致發(fā)光光譜圖［79］Fig.11 In vitro transmission(left)and PL(right)images of Panc 1 cells treated with UCNPs.Inset shows localized PL spectra taken from cells(red)and background(black)

圖12 用兔子的anti-CEA8與UCNPs結(jié)合后與He-La細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行亮場成像(a)，和用不同功率980 nm NIR激光激發(fā)(b)100，(c)300，(d)500，(e)700，和(f)900 mW［80］Fig.12 Fluorescence imaging of HeLa cells after incubated with rabbit anti-CEA8 Ab-conjugated UCNPs in bright field(a)，and excited by a 980 nm NIR laser with different excitation powers:(b)100，(c)300，(d)500，(e)700，and(f)900 mW

由于淋巴排水系統(tǒng)是癌細(xì)胞新陳代謝的一個重要途徑，但淋巴結(jié)的復(fù)雜微小結(jié)構(gòu)使得很難對它進(jìn)行識別，用NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb，Tm納米粒子作為熒光探針，Kobayashi［82］等人第一次提出了無內(nèi)源熒光的小鼠的淋巴結(jié)雙顏色成像。同樣的問題也出現(xiàn)在血管成像中，疾病中血管變化及血管功能紊亂，血管成像能提供血管的數(shù)量和間距、血管系統(tǒng)的滲透性及血管的異常，Zhang等［83］人報道了用硅烷包覆的NaYF4:Yb，Er UCNPs來動態(tài)跟蹤小鼠耳朵的成肌細(xì)胞來對血管成像。

到目前為止，在小動物中的成像做了多方面研究，而針對于腫瘤的成像在腫瘤的診斷和治療方面是非常重要的。目前，UCNPs結(jié)合葉酸、抗體和多肽能用于活體腫瘤靶向成像。F.Y.Li［84］小組近期提出了一個環(huán)肽(c(RGDFK))修飾的NaYF4:Yb，Er，Tm，并用 PEG修飾(UCNP-RGD)，來靶向成標(biāo)記αvβ3-過量表達(dá)的老鼠腫瘤(人類惡性膠質(zhì)瘤U87MG)(圖13)。

圖13 依據(jù)時間的上皮U87MG腫瘤上轉(zhuǎn)換發(fā)光(左后腿，短箭頭指出)和MCF-7腫瘤(右后腿，長箭頭指出)在無胸腺的裸鼠上實驗，在經(jīng)脈注射UCNP-RGD 24 h 后［84］Fig.13 Time-dependent in vivo upconversion luminescence imaging of subcutaneous U87MG tumor(left hind leg，indicated by short arrows)and MCF-7 tumor(right hind leg，indicated by long arrows)borne by athymic nude mice after intravenous injection of UCNPRGD over a 24 h period

4.3 生物傳感

作為波爾茲曼分布的一個性質(zhì)，UCNPs的不同發(fā)射譜帶的相對強度會依賴于周圍的環(huán)境。由于這個原因，UCNPs被提出作為納米溫度傳感器。最近，基于UCNPs的光學(xué)溫度傳感器被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)部溫度的探測，Vetrone等［85］人提出了用綠色上轉(zhuǎn)換發(fā)光的NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子，用于Hela宮頸癌細(xì)胞的溫度傳感。

作為最有效的生物傳感工具，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的方法能用于檢測生物親和性相互作用并使生物分子在納米級范圍內(nèi)產(chǎn)生改變。當(dāng)UCNPs被用作供體分子時，可能會產(chǎn)生許多新的應(yīng)用可能性，這就是發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移(LRET)。Soukka等［86，87］人在基于上轉(zhuǎn)換納米粒子的 LRET傳感上做了很多研究，他們提出了一個新穎的上轉(zhuǎn)換LRET傳感技術(shù)及其在多方面的潛在應(yīng)用可能，如在血清中對E2(17β雌二醇)免疫測定、酶活性實驗、雙參數(shù)DNA雜交試驗。

4.4 漫射光層析成像

漫射光成像已經(jīng)廣泛應(yīng)用在了小動物和人體組織的成像探測上。在人體上，漫射光成像，已經(jīng)用于探測乳腺癌腫瘤，腦活動和腦新陳代謝［88-93］。然而，由于內(nèi)源組織自發(fā)背景熒光、光在組織中傳遞的隨機性等問題的存在，漫射光成像得到的成像效果相對不是很好?，F(xiàn)有的一些改善成像質(zhì)量的方法設(shè)備復(fù)雜、計算繁多。而上轉(zhuǎn)換激發(fā)完全去除自發(fā)熒光，由圖14我們可以看出即使很弱的自發(fā)背景熒光也會給成像精度產(chǎn)生嚴(yán)重的影響［94］，同時上轉(zhuǎn)換激發(fā)不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，而較大的反斯托克斯位移也使激發(fā)光和發(fā)射光易分開。相比傳統(tǒng)的有機染料(下轉(zhuǎn)換發(fā)光過程)，上轉(zhuǎn)換納米材料的非線性性質(zhì)可以獲得更高的分辨率，這也是UCNPs在漫射光成像上的一大優(yōu)勢。

圖14 一個組織圖像中兩個圓柱形熒光目標(biāo)的熒光漫射光成像重構(gòu)圖 (a)使用UCNPs進(jìn)行的重構(gòu);(b)使用羅丹明6G進(jìn)行的重構(gòu)［94］Fig.14 LDOT reconstruction of two cylindrical luminescent targets in a tissue phantom.Reconstruction using(a)UCNPs;(b)Rhodamine 6G

4.5 輔助光動力治療

在臨床醫(yī)學(xué)上對癌癥的診斷和治療中，成像和治療是不可分開的。不同于化學(xué)療法、放射性療法和外科手術(shù)，光動力治療(photodynamic therapy，PDT)作為一個治療癌癥的技術(shù)，是被高能量光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧類(ROS)來殺死病變細(xì)胞。在癌癥組織中，有望能用980 nm的連續(xù)激光激發(fā)UCNPs穿透深層組織達(dá)到治療效果。Austin［95］首次提出了用三層的NaYF4:Yb，Er與卟啉共同定位的光動力治療。Zhang等人在 2009［96］年和 2010 年［97］分別報道了 NaYF4:Yb，Er@nSiO2@mSiO2和 NaYF4:Yb，Er@mSiO2納米粒子將 ZnPc包含在介孔的 SiO2中，在500 mW 980 nm的連續(xù)激光下激發(fā)5 min，就可以從介孔SiO2中釋放活性氧，達(dá)到PDT的治療效果。

在最近的研究工作中，Zhang等［83］人又用葉酸(FA)和PEG修飾的UCNPs分別與不做修飾及只用PBS來治療小鼠作為對比(圖15)，可以看到PDT的明顯治療效果。

圖15 照片為每組1-3只小鼠分別靜脈注射FAPEG-UCNs、未修飾的UCNP和PBS，照片顯示了注射PDT前(0 d)和注射后(7 d)的腫瘤大小的改變(用虛線圓圈標(biāo)出)。標(biāo)尺10 mm［83］Fig.15 Representative gross photos of a mouse from each group 1-3 intravenously injected with FA-PEGUCNs，unmodified UCNs or PBS showing the change in tumor size(highlighted by dashed white circles)before(0 d)and 7 d after PDT treatment.Scale bars，10 mm

4.6 多模式成像

目前，分子多模式成像的技術(shù)主要集中在X射線計算機斷層掃描技術(shù)(CT)、核磁共振成像(MRI)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(SPECT)、正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)和超聲成像等［99-101］。近年來，大量的光致發(fā)光材料的出現(xiàn)，催生了一大批研究者對于促進(jìn)在多模式造影劑存在時分子光學(xué)成像研究的興趣［102-103］，但明亮和穩(wěn)定的多模式造影劑難以找到，發(fā)光探針在多模式造影劑上容易降解和漂白。然而，UCNPs很穩(wěn)定，不存在漂白和老化現(xiàn)象，且多模式成像可以通過修飾晶體主體材料實現(xiàn)。漫射光成像，即使利用UCNPs，其空間分辨率依然不高［104］;CT和MRI具有高的分辨率，卻難以得到所需的信息;PET能提供手術(shù)前的一些詳細(xì)數(shù)據(jù)，卻不能很好適用于術(shù)后。主要討論的是，基于UCNPs的多模式成像，如磁-光學(xué)成像、核-光學(xué)成像、CT-三模式成像。

5 總結(jié)與展望

文章綜述了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子的合成方法、光學(xué)特性、發(fā)光效率的優(yōu)化及在生物方面的應(yīng)用。作為新一代生物發(fā)光標(biāo)記材料，UCNPs展現(xiàn)了許多優(yōu)點，例如毒性小、無背景熒光、化學(xué)穩(wěn)定性高、光穩(wěn)定性好、光穿透能力強等。近幾年里對UCNPs的生物應(yīng)用研究急劇增加，展現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換納米粒子的潛在應(yīng)用價值。

但是盡管UCNPs有著快速強勁的發(fā)展，它仍然有著較低的發(fā)光效率，表面修飾有待改進(jìn)，PDT的效率仍然不高。在未來的工作中，我們需要進(jìn)一步優(yōu)化材料合成，得到發(fā)光效率更高的納米粒子。同時也要優(yōu)化激發(fā)模式，發(fā)展上轉(zhuǎn)換成像的專業(yè)儀器，推動該領(lǐng)域更多更好的研究工作的展開。最后重要的是研究要向臨床應(yīng)用發(fā)展，能達(dá)到確實診斷、治療疾病的目的。

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