督脈電針對(duì)大鼠急性脊髓損傷6h后Nestin表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

北京中醫(yī)藥大學(xué)（100029）宋萌 王遠(yuǎn)征 時(shí)素華 李志剛

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指由于外界直接或間接因素導(dǎo)致脊髓在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)各種運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和括約肌功能障礙。近年來(lái)，SCI的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，且電針治療SCI已得到醫(yī)學(xué)界廣泛的認(rèn)可，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。督脈電針是電針中最常用的一種，治癱首取督脈[1]。本研究通過(guò)觀察急性SCI后Nestin的表達(dá)，探討針刺治療急性SCI的作用機(jī)制，以期為臨床針灸治療急性脊髓損傷后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠32只，體重240±20g，由北京維通利華動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組和藥物組，每組8只。

1.2 針具 針灸針用華佗牌無(wú)菌針灸針，規(guī)格：0.30×13mm。電針用韓氏（HANS）電針儀，型號(hào)LH-202H。

1.3 模型制作 用10%的水合氯醛3.5mL/kg行大鼠腹腔麻醉，固定于弓形手術(shù)臺(tái)上。按大鼠背部最下端肋骨緣橫對(duì)T13為標(biāo)志，向上依次定位T9～T11。背部脫毛后分離肌肉；用刀片自棘突向兩側(cè)剝離椎旁軟組織，暴露T9～T11段棘突和椎板；彎眼科剪剪除T10椎板及其上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突，暴露脊髓；參照經(jīng)典Allen’s打擊法，打擊T10段脊髓5cm×10g。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：鼠尾持續(xù)劇烈擺動(dòng)數(shù)秒，雙下肢及背部肌肉收縮，硬脊膜下出血，大鼠麻醉醒后雙下肢不完全癱瘓。

1.4 治療 電針組于造模后即大鼠蘇醒后先CBS評(píng)分，再選取“大椎”、“命門(mén)”進(jìn)行針刺治療，進(jìn)針約0.5～0.7cm。使用韓氏LH-202H電針儀，大椎接陰極，命門(mén)接陽(yáng)極，持續(xù)脈沖電流，2Hz，治療20min。藥物組于造模后以30mg/kg體重的甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈注射?？瞻捉M和病理組不做任何治療，但要在同一時(shí)間均抓取一次。

1.5 取材 造模后6h大鼠麻醉，行心臟灌注術(shù)：開(kāi)胸暴露心臟，行左心室、主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水200mL，灌注8%多聚甲醛的磷酸緩沖液300mL固定至動(dòng)物肢體僵硬后，以撞擊點(diǎn)為中心，取出損傷部位（節(jié)段T9～T11）及其近、遠(yuǎn)端各2個(gè)節(jié)段，約1cm長(zhǎng)脊髓浸入固定液。

1.6 檢測(cè) 將組織經(jīng)固定液固定、沖洗、梯度脫水、浸蠟、制石蠟切片（厚度6μm）進(jìn)行Nestin表達(dá)檢測(cè)：下行脫水，雙蒸水洗滌；加入0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液30min，雙蒸水清洗5min×2 ；枸櫞酸鈉緩沖液PBS洗10min×3；加入羊血清1～2滴，37℃溫箱存放30min；吸干羊血清，加入稀釋的一抗，保濕盒中4℃，36h；將保濕盒移入溫箱（37℃）1h，PBS洗5min×3；加入二抗，室溫孵育2h，PBS洗10min×3；加入三抗，室溫孵育2h，PBS洗10min×3；DAB顯色：加入顯色液，不超過(guò)30min，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)吸去顯色液，PBS洗10min×3；梯度酒精脫水之后，中性樹(shù)膠封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用軟件進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用方差分析。以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

Nestin在細(xì)胞胞漿中表達(dá)為棕褐色顆粒，主要集中于脊髓中央管室管膜、脊髓背側(cè)出血壞死區(qū)?？瞻捉M僅見(jiàn)少量巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞（見(jiàn)附圖1）；模型組、電針組與藥物組在脊髓損傷后6h巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加（見(jiàn)附圖2、3、4和附表）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脊髓損傷后所產(chǎn)生的各種癥狀，乃因瘀阻督脈，樞機(jī)統(tǒng)帥失職，三陽(yáng)經(jīng)氣血逆亂而致。其病因?yàn)椤梆鲅?，病機(jī)為“督脈樞機(jī)不利”。因此，在治療上應(yīng)以疏通督脈以壯一身之陽(yáng)氣，使氣血調(diào)達(dá)、氣機(jī)調(diào)暢。而督脈電針能夠疏通督脈，溫腎壯陽(yáng)，活血化瘀，使陽(yáng)氣通達(dá)全身，使精血養(yǎng)四肢而恢復(fù)機(jī)體的各項(xiàng)功能。實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)督脈電針可以起到對(duì)脊髓神經(jīng)的保護(hù)作用和促進(jìn)脊髓神經(jīng)的再生作用[2]。

附表 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域面積（±s，μm2）

附表 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域面積（±s，μm2）

注：與空白組比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

動(dòng)物分組 數(shù)量（n） SCI后6h Nestin的表達(dá)空白組 8 31.280±20.678模型組 7 248.815±83.982**藥物組 7 596.030±153.854**▲▲電針組 8 605.322±167.541**▲▲

附圖2 6h模型組（50μm）

附圖3 6h電針組（50μm）

附圖4 6h藥物組（50μm）

本實(shí)驗(yàn)觀察到電針能促進(jìn)急性脊髓損傷后Nestin大量表達(dá)。而Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白[3]，往往與細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)，這就表明電針對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖作用。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，6h電針組和藥物組的傷段脊髓組織Nestin含量都升高，有顯著性差異（P＜0.05），電針組和藥物組之間Nestin含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞少，這可能是神經(jīng)干細(xì)胞在SCI病理情況下的反應(yīng)性增殖，以彌補(bǔ)神經(jīng)系統(tǒng)組織學(xué)缺失。因此，成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的神經(jīng)干細(xì)胞可能參與損傷過(guò)程的神經(jīng)元再生和組織修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)Nestin的數(shù)據(jù)結(jié)果提示電針對(duì)大鼠SCI后神經(jīng)功能有保護(hù)作用，電針提高了Nestin含量即促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞增多來(lái)起到促進(jìn)SCI再生修復(fù)和功能恢復(fù)的作用。其參與機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：①電針促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的代償性修復(fù)，減輕神經(jīng)功能缺損以及病理?yè)p害程度；②電針治療早期SCI，即急性期SCI，可顯著改善損傷局部的血流量，提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[4]，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[5]，清除氧自由基。這提示電針既能激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，使其與神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的巢蛋白的表達(dá)保持在較高水平，又能改善損傷局部微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌；③督脈電針可能通過(guò)促進(jìn)受損傷脊髓組織細(xì)胞的代謝過(guò)程，引起細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性升高，使ATP生成cAMP增加，從而激活了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等蛋白質(zhì)的合成和分泌過(guò)程，從而促進(jìn)脊髓內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞存活和分化，以及促進(jìn)受損傷神經(jīng)元的存活及其軸突再生，重建神經(jīng)通路，恢復(fù)脊髓的功能[6]。

SCI損傷后的再生修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，電針在誘異脊髓損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化上顯示出巨大的潛力，標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的Nestin也不容忽視。隨著對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞作用研究的不斷深入，督脈電針對(duì)急性脊髓損傷后的治療方面必將顯示出更為廣闊的前景。