酶解雞骨架制備熱反應(yīng)底物的研究

趙永珍， 張 慜*， 陳志雄

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣東嘉豪食品股份有限公司，廣東 中山528447）

雞肉香味鮮美，風(fēng)味怡人，深受人們的喜愛。為此，人們希望能給一些食品賦予雞肉香味，由此促進(jìn)了人們對雞肉香精的研究。雞汁調(diào)味料是以磨碎的雞肉和雞骨或其濃縮提取物以及其他輔料等為原料，添加或不添加香辛料和（或）食用香料等增香劑加工而成，具有雞的濃郁鮮味和香味的汁狀復(fù)合調(diào)味料。熱反應(yīng)產(chǎn)生的雞肉香精由于香氣強(qiáng)烈、逼真度高、抗氧化性好受到研究人員的重視。近年來，國外對熱反應(yīng)雞肉香精的研究較為活躍，而國內(nèi)在這方面的研究還相對薄弱和滯后，到目前為止，關(guān)于如何生產(chǎn)雞肉香精的有關(guān)信息還較少[1]。

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸鈉鹽與多肽，其通?？勺鳛轷r味料或通過與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)制備熱加工肉類香精。Spanier的研究表明：多肽在牛肉加工、水解植物蛋白、烤可可與咖啡的風(fēng)味形成過程中起著非常重要的作用，不同的多肽序列作為前體物質(zhì)將產(chǎn)生不同的食品風(fēng)味。因此，當(dāng)通過美拉德褐變生產(chǎn)特定風(fēng)味化合物時，水解蛋白的游離氨基酸的組成與含量、相對分子質(zhì)量分布、多肽的組成及化學(xué)構(gòu)型等對美拉德反應(yīng)中形成的風(fēng)味物質(zhì)的種類等具有非常重要的影響[2-3]。

目前肉味香精發(fā)展于近30年，其主流是酶解技術(shù)用于水解氮源物質(zhì)，用水解動物蛋白（HAP）、水解植物蛋白（HVP）作為肉味香料的前體物，再配合以氨基酸、酵母膏、還原糖和脂肪等物質(zhì)，經(jīng)美拉德反應(yīng)形成香氣濃郁圓潤、口感醇厚逼真的肉味香精[4]。

作者以雞骨架為底物，通過酶法水解制備雞骨架蛋白水解物，作為Maillard的反應(yīng)物，用以對不同水解度的酶解產(chǎn)物對美拉德產(chǎn)物風(fēng)味形成的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

凍藏雞骨架：購于無錫市濱湖區(qū)歐尚超市；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶，Protamex復(fù)合蛋白酶，木瓜蛋白酶，Novozym37071酶：廣州明耀商貿(mào)有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，立式高壓蒸汽滅菌鍋，精密酸度計，絞肉機(jī)，消化爐，改良式凱氏定氮裝置，電子天平，冷凍離心機(jī)，馬弗爐，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 測定方法

1.3.1 酶解工藝的研究方法

1）酶的選擇實驗：采用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶（F：P），風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶（F：PP）以及風(fēng)味蛋白酶和Novozym37071酶 （F：N）3種不同復(fù)配酶進(jìn)行水解，對酶解液的水解度及感官進(jìn)行比較，選擇最佳復(fù)配酶。復(fù)配酶的兩種酶質(zhì)量比為1∶1，酶用量為0.4%，料液質(zhì)量體積比為1 g∶2 mL，在各自的適宜水解條件下水解。

酶適宜作用條件根據(jù)酶生產(chǎn)廠家提供的資料和預(yù)試驗確定：風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶適宜溫度為55℃，pH為6.0；，風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶的適宜溫度 55 ℃，pH 6.5； 料液比 1 g∶2 mL，Novozym 37071酶和風(fēng)味蛋白酶的適宜溫度55℃，pH為6.5。

2）酶配比的選擇：用以上所確定的最佳酶組合，選擇不同的雙酶組合比例，以水解度和蛋白質(zhì)回收率為考察指標(biāo)，選擇最優(yōu)配比。

3）酶用量的選擇：選定料液比為 1 g∶2 mL，水解時間3 h，酶用量0.2%～1.0%，pH值6.8，水解時間3 h，測定其DH，確定最適酶用量。

4）料液比的選擇：選定pH 值6.8、溫度55℃、上述確定的酶用量料液質(zhì)量體積比分別在1 g∶1 mL～1 g∶5 mL 條件下水解 3 h，分別測定其 DH，確定最佳料液比。

5）酶解溫度的選擇：選定水解時間3 h，pH值6.8，上述確定的酶用量，料液質(zhì)量體積比，分別在45～65℃條件下水解，分別測定D H，確定最適酶解溫度。

6）酶解pH值的選擇：選定水解時間3 h，上述所確定的酶用量、溫度，及料液質(zhì)量體積比，pH值為5.5～7.5，分別測定其DH，確定其最適pH值。

7）酶解時間的選擇：按選定的最佳參數(shù)，酶解時間分別為1～7 h測定其水解度，確定最佳酶解時間。

8）最佳工藝條件的確定：根據(jù)單因素試驗的結(jié)論，選擇酶解溫度、時間、pH值、加酶量4因素，每因素三水平設(shè)計正交試驗，其因素水平設(shè)計見表1。取 L9（34）正交表，做正交試驗。

表1 復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of enzymolysis condition byFlavourzyme andProtamex

1.3.2 雞骨架酶解的工藝流程 雞骨架→預(yù)處理→高溫蒸煮（120℃，1 h）→粉碎→加去離子水→調(diào)節(jié)pH值→加酶恒溫水解→100℃滅酶15 min→4 800 r/min離心20 min→過濾→雞骨架水解蛋白液。

1.3.3 檢驗方法 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：凱氏定氮法：GB/T5009.5-2003；水解度的測定：參照參考文獻(xiàn)[5]

氨基酸態(tài)氮的測定：甲醛滴定法，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.39-2003。蛋白質(zhì)利用率的測定：按以下公式計算。

蛋白質(zhì)利用率=（酶解上清液中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)/原料中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)）×100%

產(chǎn)品感官品評[6]：就樣品的嗅感、口味、色澤、外觀等方面評價產(chǎn)品的質(zhì)量，各指標(biāo)按很弱 （----）、弱（---）、較弱（--）、稍弱（-）、一般/不存在（0/×）、稍 好 （+）、較 好 （++）、好 （+++）、很 好（++++），由5人組成感官評價小組，對不同工藝的產(chǎn)品進(jìn)行對比鑒評，根據(jù)可接受性進(jìn)行綜合評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料的預(yù)處理

首先是對凍藏的雞架進(jìn)行解凍，然后對原料進(jìn)行清洗、去雜，特別是雞架，還有一些內(nèi)臟殘留物要去除；另外是汆湯，主要目的是去血去異味，因為血污都含有不同的腥味，如果直接蒸煮，會使湯液帶腥且混濁，影響風(fēng)味及色澤，所以必須經(jīng)過汆燙，讓殘留的血凝固，經(jīng)過沖洗后以除去血及一些異味且經(jīng)過汆湯后所得雞湯較清澈。在工業(yè)化生產(chǎn)中不能像傳統(tǒng)方法那樣，邊熬煮邊撇去浮沫，可將粉碎后的骨頭用冷水浸泡20 min是骨頭中的血液滲透到水中，這樣就可以把浮沫的問題解決好[7]。

另外，為了增加骨內(nèi)含物與水的交流，有必要對骨頭適當(dāng)破碎和加壓處理，便于呈味物質(zhì)的溶出。利用高壓處理可分解膠原蛋白為可溶性水解物，讓人們?nèi)菀孜者@些小分子營養(yǎng)物，且高壓把骨渣充分預(yù)處理，骨頭變酥更易于酶與底物的接觸，酶解主要作用于肌肉纖維中的蛋白和部分已經(jīng)溶出的膠原蛋白，這樣可以提高原料的利用率。作者采用120℃蒸煮1 h，時間小于1 h時尚有骨頭沒有充分變酥，大于1 h時，蒸煮液的蒸煮味嚴(yán)重，故選擇1 h為宜。

2.2 酶的選擇

2.2.1 酶的種類選擇 酶法水解的動物蛋白有一定的苦味，NEYKH[8]等曾研究表明蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味和蛋白質(zhì)的疏水性值有關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)疏水值較大時，用不含端肽酶的蛋白酶水解就會產(chǎn)生較強(qiáng)的苦味?？辔峨牡亩嘶酁槭杷被?，如果用外切酶切除此類疏水氨基酸，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低的多。風(fēng)味蛋白酶既是內(nèi)切酶也是外切酶，因此風(fēng)味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦。所以采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及Novozym37071酶這3種內(nèi)切蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比1∶1復(fù)配后，在各自適宜的條件下對雞骨蛋白的酶解效果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1。

圖1 不同酶對水解度影響Fig.1 Effect of enzyme on degree of hydrolysis

表2 F∶P酶解不時間對感官指標(biāo)的影響Table 2 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Protamex

表3 F∶PP酶解不同時間對感官指標(biāo)的影響Table 3 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Papain

表4 F∶N酶解不同時間對感官指標(biāo)的影響Table 4 Effects of enzymolysis time onSensory indexesby Flavourzyme andNovozym37071

通過比較發(fā)現(xiàn)利用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配進(jìn)行酶解所得的酶解液水解度最高，且總體風(fēng)味最好，故以下實驗采用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶解制取雞骨蛋白酶解液。

2.2.2 酶的配比選擇 由圖2可知，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶用量逐漸增多，復(fù)合蛋白酶所占比例變小時，水解度不斷增加，而蛋白質(zhì)的利用率卻在減小。在比例為1∶2時，水解度與蛋白質(zhì)回收率相對較高。因此，從酶解效果和經(jīng)濟(jì)角度考慮，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶配比為1∶2時為最佳方案。有關(guān)酶解的研究表明，復(fù)合蛋白酶的內(nèi)肽酶較強(qiáng)，總體的水解力較強(qiáng)，但水解程度不夠徹底；而風(fēng)味蛋白酶的端肽酶較強(qiáng)，能更徹底地將蛋白質(zhì)和肽水解成為氨基酸，這可能是導(dǎo)致當(dāng)風(fēng)味蛋白酶的比例增加時水解度增加而蛋白質(zhì)利用率下降的原因[9]。

圖2 復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的配比對水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of ratioof Flavourzyme and Protamex on degree of hydrolysis and Protein recovery

2.3 單因素結(jié)果分析

2.3.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 當(dāng)料液比一定，增加的酶量又未使底物濃度飽和時，加酶量越大，反應(yīng)速度也越快，蛋白質(zhì)的水解度也越高。但當(dāng)繼續(xù)增加加酶量，生產(chǎn)成本也相應(yīng)提高，同時，也有可能導(dǎo)致酶自身相互水解，使酶活力降低，實驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，水解度隨加酶量的增大而增加，但加酶量大于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時，酶解度增加減緩，考慮到生產(chǎn)成本問題，選擇加酶量0.8%較為合適。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.2 料液比的選擇 料液比對水解反應(yīng)效果有影響，主要是因為料液質(zhì)量體積比的變化會引起酶反應(yīng)體系中底物和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。由圖4可知，隨著料液質(zhì)量體積比的增加，水解度不斷增加。而實際生產(chǎn)中，水分過多，濃度則越稀，作為商品，仍需要濃縮，耗能大。綜合考慮，確定料液質(zhì)量體積比為 1 g∶2 mL。

圖4 料液比對水解度的影響Fig.4 Effect of solid liquid ratio on degree of hydrolysis

2.3.3 酶解溫度的選擇 由圖5可知，在一定的溫度范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的升高，水解度不斷增加但超過一定溫度后，水解度會隨著溫度的升高而降低。這是因為在一定范圍內(nèi)升高溫度，反應(yīng)速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，但溫度過高，酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率隨之降低。所以，最適溫度為55℃。

2.3.4 酶解pH值的選擇 pH值影響酶的穩(wěn)定性，所以pH值對水解反應(yīng)影響很大。各種酶都有各自的最適pH值范圍，由圖6可知，pH 6.5左右時，水解度最大，所以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合的最適pH值取6.5。

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 Effects of temperature on degree of hydrolysis

圖6 pH對水解度的影響Fig.6 Effects of pH on degree of hydrolysis

2.3.5 酶解時間的選擇 由圖7可知，隨著時間的增加，水解度不斷增加，當(dāng)增加到一定程度，時間為3 h的時候，增加的速度開始變慢，綜合考慮效率及成本的問題，單因素水解時間最優(yōu)選4 h。

圖7 酶解時間對水解度的影響Fig.7 Effects of enzymolysis time on degree of hydrolysis

2.4 最佳工藝條件的確定

通過酶解單因素試驗選擇最佳的條件，根據(jù)L9（34）正交表對其進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，結(jié)果見表5，趨勢圖見圖8。由表5和圖8可以看出，各因素影響的主次關(guān)系為D＞C＞B＞A即酶用量>酶解時間>酶解溫度>酶解pH。各因素的最優(yōu)水平組合為D3C3B2A2即酶用量為8‰，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，酶解pH值為6.5。

表5 酶解正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Design and resultsoforthogonaltestfor enzymolysis

圖8 酶解正交試驗因素趨勢圖Fig.8 Statistic curve oforthogonalfactorsduring enzymolysis

3 結(jié)語

作者通過對不同種類的酶水解所得的酶解液的感官品評及水解度的比較，篩選出最佳的酶組合為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，當(dāng)兩者以1∶2的質(zhì)量比復(fù)配時，蛋白質(zhì)回收率及水解度都相對較高。并在一系列的單因素基礎(chǔ)上，以水解度為特征指標(biāo)，通過4因素3水平正交實驗對復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配水解雞骨架工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳酶解工藝條件為溫度55℃，pH值6.5，加酶量0.8%，水解時間5 h。此時酶水解雞骨泥的水解度為23.69%。在后續(xù)的研究中，可以在以上優(yōu)化條件下改變水解時間，獲得不同相對分子質(zhì)量的多肽和氨基酸的酶解液，以研究不同水解度的蛋白質(zhì)水解液對美拉德反應(yīng)的影響。

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