不同溫度下嗅覺可視化技術(shù)區(qū)分豬肉中主要致腐菌

鄒小波， 郭雅寧， 石吉勇， 黃曉瑋， 黃 林， 李 昕

（江蘇大學(xué) 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

目前豬肉中致腐菌的檢測(cè)方法有GC/MS[1-2]、微生物培養(yǎng)[1]等方法。這些方法可以準(zhǔn)確地區(qū)分豬肉中的不同致腐菌，但是過程復(fù)雜、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高，不能做到快速檢測(cè)及時(shí)判斷。目前大部分研究?jī)H針對(duì)4℃冷藏貯藏條件下的豬肉致腐菌檢測(cè)[3-6]。在我國(guó)很多地方，豬肉從屠宰到餐桌往往要經(jīng)歷冷凍、冷藏等多種貯藏方式，甚至在冷鏈不完善的地區(qū)還要在常溫下貯藏，因此有必要針對(duì)室溫（20℃），冷藏（4℃）和冷凍（-16℃）3種貯藏溫度條件下，對(duì)豬肉中主要致腐菌的快速、無(wú)損檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究。

嗅覺可視化技術(shù)是一種氣體成像技術(shù)[7-9]，該技術(shù)根據(jù)可視化傳感器與待測(cè)氣體反應(yīng)前后的顏色變化對(duì)氣體進(jìn)行定性定量判別[10-12]?？梢暬瘋鞲衅鞑粌H利用氣體敏感材料和待測(cè)氣體之間的范德華力等很弱的相互作用，而且引入了金屬鍵和極性鍵等較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)，所以在檢測(cè)精度和靈敏度方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[13-15]。

豬肉貯藏過程中主要致腐菌對(duì)豬肉腐敗起主導(dǎo)作用，其利用豬肉中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自身代謝，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如硫化物、胺類等可導(dǎo)致豬肉的氣味和pH值發(fā)生變化，同時(shí)這些氣體的種類和濃度與微生物種群及其數(shù)量也有密切的關(guān)系。作者精心挑選4種卟啉化合物組成可視化傳感器，分別在室溫（20℃）、冷藏（4℃）和冷凍（-16℃）3種貯藏條件下，通過嗅覺可視化傳感器與揮發(fā)性氣體反應(yīng)前后的顏色變化，嘗試對(duì)豬肉中的3種主要致腐菌進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與菌種 豬肉購(gòu)于江蘇省鎮(zhèn)江市屠宰場(chǎng)，為生鮮背最長(zhǎng)肌。按照文獻(xiàn)[1]所述方法取其內(nèi)部無(wú)污染肉塊約1 080 g，修去筋腱。

豬肉貯藏過程中的主要致腐菌為韓國(guó)假單胞桿菌、熱殺索絲菌及梭狀芽胞桿菌，它們均為實(shí)驗(yàn)室分離純化、鑒定后保存的菌種[1，16-20]。

1.1.2 試劑 無(wú)菌生理鹽水，體積分?jǐn)?shù)75%酒精，卟啉試劑（Sigma，美國(guó)）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 壓力蒸汽滅菌鍋（YM50型，上海，三申醫(yī)療器械）；雙人單面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2FD 型，蘇州）；冰箱（美的，合肥）；生物顯微鏡（XS-212-202 型，南京，JNOEC）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150型，上海，一恒科技）；掃描儀（Scanjet G4050型，美國(guó)，HP）。

1.2 樣本制備

1.2.1 肉塊的制備 于無(wú)菌操作臺(tái)將豬肉分割成108塊，精確稱取10 g左右的均勻小塊，進(jìn)行表面滅菌后裝入無(wú)菌薄膜袋中備用。

1.2.2 接種與貯藏 參照文獻(xiàn)[1]的方法，韓國(guó)假單孢菌、熱殺索絲菌和梭狀芽孢桿菌經(jīng)過培養(yǎng)，獲得菌原液。取上述分割好的無(wú)菌肉塊12塊作為對(duì)照組，再取36塊分為3組，每組12塊，分別浸泡于3種菌原液中，15 s后取出，瀝干菌液，裝入無(wú)菌薄膜袋中[14]。將接種后的豬肉按類分別放在20、4℃和-16 ℃條件下貯存，20 ℃條件下分別于 0、8、16、24 h后取樣分析，4℃條件下分別于 0、2、4、6 d后取樣分析，-16℃條件下分別于0、3、6、9 d后取樣分析。

1.2.3 腐敗菌計(jì)數(shù) 參照文獻(xiàn)[21]的方法，在無(wú)菌操作條件下，將樣品剪碎放入含有10 mL滅菌生理鹽水的滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分研磨做成均勻稀釋液。用無(wú)菌微量移液器吸取0.1 mL樣品勻液，沿管壁緩慢注入盛有10 mL稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，制成體積比1∶100的樣品勻液。選擇2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 嗅覺可視化技術(shù)檢測(cè)方法

1.3.1 傳感器的制作 針對(duì)豬肉腐敗過程中氣味變化的特點(diǎn)，從200多種卟啉中優(yōu)選出4種與豬肉揮發(fā)氣體發(fā)生反應(yīng)最靈敏的卟啉化合物組成可視化傳感器陣列。為減少環(huán)境濕度對(duì)傳感器精度的影響，選擇具有良好疏水性的C2反相硅膠板作為傳感器載體，其微小的孔徑可以幫助吸附氣體分子加快檢測(cè)速度。利用毛細(xì)管點(diǎn)樣法將氣敏材料固定在傳感器載體，形成一個(gè)如圖1所示的2×2的可視化傳感器陣列。

圖1 傳感器陣列Fig.1 Sensor array

1.3.2 跟蹤檢測(cè) 取已準(zhǔn)備好的60塊豬肉，將其放在特制的容器底部，將傳感器陣列放置在容器頂部，然后將裝置密封放于恒溫避光處?？梢暬瘋鞲衅麝嚵猩仙舨牧希ㄟ策┑念伾兓脪呙鑳x掃描獲取[15-16]。針對(duì)不同溫度下的樣品，跟蹤監(jiān)測(cè)的間隔不一樣，20℃下每隔8 h掃描一次，4℃下每隔2 d掃描一次，-16℃下每隔3 d掃描一次。

1.4 傳感器響應(yīng)信號(hào)提取和數(shù)據(jù)建模分析

可視化傳感器與豬肉頂空可揮發(fā)性氣體發(fā)生顏色反應(yīng)，只有對(duì)傳感器與豬肉氣體發(fā)生反應(yīng)前后的圖像進(jìn)行圖像處理，使其數(shù)字化，才能對(duì)這些變化進(jìn)行定量描述，進(jìn)而用來(lái)檢測(cè)樣品。由掃描儀獲得的傳感器反應(yīng)前后圖像經(jīng)過圖像處理，通過如下公式提取可視化傳感器陣列上色敏材料 （卟啉）反應(yīng)前后顏色變化的絕對(duì)值ΔR、ΔG、ΔB。

式中，a（after）代表可視化傳感器陣列與待檢測(cè)氣體反應(yīng)后的圖像，b（before）代表可視化傳感器陣列與待檢測(cè)氣體反應(yīng)前的圖像。將ΔR、ΔG、ΔB值作為輸入變量，應(yīng)用Matlab7.0軟件建立模型進(jìn)行PCA分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 致腐菌變化規(guī)律

圖2（a）（b）（c）分別為-16、4 和 20 ℃條件下豬肉中3種主要致腐菌（韓國(guó)假單胞桿菌、熱殺索絲菌、梭狀芽胞桿菌）的菌總數(shù)變化圖。從圖2中可以看出在這3種溫度下豬肉的致腐菌總數(shù)的初始值均為103-104個(gè)/g。隨豬肉存放時(shí)間的增加，3種腐敗菌的總數(shù)均呈明顯的上升趨勢(shì)。

圖2 -16，4，20℃下豬肉中菌數(shù)變化情況Fig.2 Bacteria count changes in pork at-16，4，20 ℃

如圖2（a）所示，在-16℃條件下，致腐菌菌總數(shù)在第9天時(shí)達(dá)到107個(gè)/g。菌總數(shù)與初始值相比增加了一倍，韓國(guó)假單胞桿菌明顯是優(yōu)勢(shì)菌。如圖2（b）所示，在4℃條件下，由于溫度升高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率相對(duì)加大，在第6天的時(shí)候就已經(jīng)達(dá)到107個(gè)/g，此時(shí)也達(dá)到了初始菌數(shù)的兩倍。如圖2（c）所示，在20℃條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)速率明顯加大，在16 h后就已達(dá)到107個(gè)/g，在24 h后達(dá)到108個(gè)/g并伴隨著明顯的腐臭味，在這3種溫度條件下，豬肉中3種主要致腐菌的生長(zhǎng)速率的增加程度都比較明顯，且韓國(guó)假單胞桿菌是造成豬肉腐敗的主要菌群，在-16℃條件下尤其明顯，結(jié)果與文獻(xiàn)[1]一致。

2.2 嗅覺可視化技術(shù)檢測(cè)

表1為20、4℃和-16℃ 3種貯藏溫度下，嗅覺可視化傳感器跟蹤檢測(cè)染有3種致腐菌豬肉樣本的特征圖像。由特征圖像可以看出，每幅圖的反應(yīng)變化都有所不同，隨著豬肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，傳感器的響應(yīng)范圍在擴(kuò)大，且反應(yīng)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。從嗅覺可視化傳感器陣列顏色變化（圖3）中，能夠看出染有3種致腐菌（韓國(guó)假單胞桿菌、熱殺索絲菌、梭狀芽胞桿菌）的豬肉樣本有明顯的差異，并且在不同溫度下（不同貯藏時(shí)間）（20 ℃（8、16、24 h），4 ℃（2、4、6 d），-16 ℃（3、6、9 d））豬肉的變質(zhì)情況不同。這是由于不同的菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的差異，并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，豬肉頂空揮發(fā)性氣體成分的種類和濃度不斷變化所致。

前期相關(guān)研究[15，21]表明，生鮮豬肉處于貯藏初期，新鮮度高，揮發(fā)性氣體成分較少，多是烴類和酮類等氣體，只能通過與少許金屬卟啉發(fā)生非特異性吸附，反應(yīng)強(qiáng)度較弱。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，生鮮豬肉品質(zhì)開始下降，與腐敗有關(guān)的含硫含氮?dú)怏w分子開始產(chǎn)生。此時(shí)，金屬卟啉容易與含硫和含氮?dú)怏w分子發(fā)生特異性吸附，金屬卟啉中的金屬離子與這些化合物中的硫原子和氮原子發(fā)生鍵合得到電子對(duì)形成配位鍵，從而引起較強(qiáng)烈反應(yīng)，傳感器反應(yīng)強(qiáng)度愈來(lái)愈明顯。對(duì)照組豬肉樣本由于其自身內(nèi)部含有少量細(xì)菌導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，并且每種致腐菌在不同溫度下生長(zhǎng)速度不一樣，產(chǎn)生的氣味也有差別。染有韓國(guó)假單胞菌豬肉樣本產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體中含硫化合物、酯和酸比較多；染有熱殺索絲菌豬肉樣本產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體中揮發(fā)性酸較多；染有梭狀芽胞桿菌豬肉樣本的揮發(fā)性氣體中分子胺和氨類物質(zhì)較多。這也就是可視化氣體傳感器可以區(qū)分不同菌種不同貯藏時(shí)間的主要原因。

圖3 豬肉在20℃、4℃和-16℃下0～24 h、0～6 d和0～9 d的特征圖像Fig.3 Feature images of pork storing below 20 ℃，4 ℃ and-16 ℃ during 0～24 h，0～6 d and 0～9 d

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

在-16、4℃和20℃這3種貯藏溫度下，傳感器陣列圖像上每個(gè)卟啉化合物的ΔR、ΔG、ΔB值組成3個(gè)15×4×3的矩陣，將這些矩陣分別進(jìn)行主成分分析。在20℃常溫條件下的第一主成分的貢獻(xiàn)率為59.82%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為21.34%；在4℃冷藏條件下的第一主成分的貢獻(xiàn)率為64.48%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為22.32%；在-16℃冷凍條件下的第一主成分的貢獻(xiàn)率為67.23%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為24.41%。樣本經(jīng)PCA分析后的數(shù)據(jù)前兩個(gè)主成分的二維投影如圖 4 所示，圖 4（a）（b）（c）分別為3種貯藏溫度條件下，傳感器區(qū)分對(duì)照組、染有梭狀芽孢桿菌樣本、染有熱死環(huán)絲菌樣本、染有假單胞菌樣本的情況。

從圖3中可以明顯看出，3種染菌組均能相互分開。

圖4 主成分分析結(jié)果Fig.4 Principal component scatter plot

圖3（a）為20℃條件下的主成分分析結(jié)果，染有韓國(guó)假單胞桿菌的14個(gè)樣本均能被正確識(shí)別，1個(gè)樣本被誤判為染有熱死環(huán)絲菌樣本組；染有熱殺索絲菌和梭狀芽胞桿菌的豬肉樣本組均能被正確識(shí)別，總體識(shí)別率達(dá)到98%。

3 結(jié)語(yǔ)

在-16、4、20℃這3種貯藏溫度下，嗅覺可視化技術(shù)結(jié)合主成分分析方法對(duì)豬肉中的3種主要致腐菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示韓國(guó)假單胞桿菌樣本組的識(shí)別率為98%，梭狀芽孢桿菌和熱殺索絲菌樣本組的識(shí)別率均為100%。表明，應(yīng)用嗅覺可視化技術(shù)可以區(qū)分豬肉中的上述3種主要致腐菌。

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