參麥注射液對大鼠肢體缺血-再灌注損傷后骨骼肌細胞凋亡的影響

林 楠 謝慶平 郭恩琪 浙江省人民醫(yī)院 杭州310014

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury），是顯微外科肢體創(chuàng)傷修復(fù)，斷肢再植等不可避免的問題，骨骼肌在重新獲得血液灌注或氧供后，不僅不能使其恢復(fù)，反而因此導(dǎo)致組織代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進一步加重[1]，直接影響著創(chuàng)面修復(fù)、功能恢復(fù)的成功與否。參麥注射液（shenmai injection）由紅參、麥冬加工、提煉、精制而成，源出《癥因脈治》之參麥飲，具有益氣養(yǎng)陰，生津復(fù)脈之功效。本實驗探討參麥注射液對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護機制，為臨床應(yīng)用獲取實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 選用SPF級SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質(zhì)量200～220g，自由飲水，室溫（25±2）℃，分籠喂養(yǎng)。由浙江省醫(yī)學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（浙）2008-0033）。30 只大鼠按隨機數(shù)字表法，分為缺血再灌注模型組，缺血再灌注參麥組和假手術(shù)組，每組10 只。

1.2 主要試劑 參麥注射液（杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，每支10mL，批號010873），免疫組化染色試劑盒（美國ZYMED 公司生產(chǎn)，杭州達文生物有限公司提供）Bcl-2 單抗、Fas 單抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，杭州達文生物有限公司提供）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 所有動物在實驗前夜停止喂食，不禁水。用10%水合氯醛，0.4mL/0.1kg 腹腔注射麻醉，每3h 追加1 次（0.2mL/0.1kg）以維持麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定于木板上，腹股溝區(qū)脫毛，常規(guī)消毒。取右下肢腹側(cè)切口,顯露股動脈、靜脈，用無創(chuàng)手術(shù)縫線活結(jié)扎閉股動靜脈，并于手術(shù)顯微鏡下觀察，確認血流阻斷后，將股骨干后方肌群完全切斷，再將肌肉原位縫合，關(guān)閉皮膚。缺血4h 后，打開右側(cè)皮膚切口，解除結(jié)扎線，手術(shù)顯微鏡下觀察血流恢復(fù)，管腔內(nèi)無血栓，則再灌注成功?？p合皮膚，可以觀察到動脈血流恢復(fù)后手術(shù)鼠爪由暗紫為粉紅。假手術(shù)組不結(jié)扎股動靜脈，4h 后給予生理鹽水4mL/kg 腹腔注射。模型組在恢復(fù)血流，即再灌注即刻，給予生理鹽水4mL/kg 腹腔注射；參麥組再灌注即刻，給予參麥注射液4mL/kg 腹腔注射[按成人體表面積換算：大鼠（200g）/人（70kg）=0.018/1]。

2.2 取 材 模型組與參麥組分別予再灌注1h，假手術(shù)組為5h 后的時間點，經(jīng)腹主動脈放血致死動物后即刻切取患肢腓腸肌組織，所取組織用4%多聚甲醛及時固定，待做石蠟切片及免疫組化檢測。

2.3 觀察指標 免疫組織化學染色：按免疫組織化學染色劑盒程序進行。石蠟片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS（pH7.4）緩沖液浸泡5min，3%H2O2去離子水孵育10min，滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15min，傾去，滴加一抗（兔抗Bcl-2，兔抗Fas 均為1:100），4℃冰箱過夜。PBS（pH7.4）緩沖液沖洗3 次，每次3min，加二抗（山羊抗兔IgG)37℃孵育15min，PBS（pH7.4）緩沖液洗3 次，每次3min，滴加辣根酶標記鏈酶卵蛋白素工作液（S-A/HRP），37℃孵育15min，PBS（pH7.4）緩沖液洗3 次，每次3min，DAB 顯色劑顯色15min，自來水終止顯色。

2.4 結(jié)果分析 應(yīng)用BI-2000 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)軟件對腓腸肌組織切片進行分析，低倍鏡下（×100）以相同外部條件（亮度）攝取圖像，每張切片隨機選擇3個視野，得出統(tǒng)計場平均光密度值（AOD），每個實驗組分別選取相應(yīng)的切片，計算骨骼肌細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。高倍鏡下,隨機計數(shù)1000個骨骼肌細胞核，平均100個細胞核中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的數(shù)目為AI。

3 實驗結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察 Bcl-2 陽性細胞染成棕黃色顆粒狀為基因表達陽性，F(xiàn)as 陽性細胞染成棕黃色或棕褐色顆粒狀。光學顯微鏡下觀察大鼠腓腸肌的肌細胞，模型組Fas 陽性細胞數(shù)量較多，胞漿淡棕色深染，且胞漿內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒較多，排列密集，Bcl-2的表達較少，胞漿淡染，胞漿散在棕黃色或黃色顆粒。參麥組少量Fas 陽性細胞表達，棕黃色或黃色顆粒，散布于胞漿，胞漿顏色淡染，Bcl-2 陽性細胞數(shù)量多，胞漿顏色深染，且胞漿內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒較多，排列密集。

3.2 Bcl-2 及Fas 蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組Fas、Bcl-2 表達均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，參麥組Fas 表達顯著降低，Bcl-2 表達提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠腓腸肌組織Bcl-2 及Fas 蛋白表達比較（）

表1 三組大鼠腓腸肌組織Bcl-2 及Fas 蛋白表達比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

4 討論

肢體缺血再灌注損傷是臨床顯微外科創(chuàng)傷，如斷肢再植、四肢大血管損傷、血栓形成[2]、血管危象的再通、骨筋膜室綜合征等常見的病理過程。骨骼肌缺血再灌注，輕者可致肌肉纖維化攣縮，影響功能；重者可致肢體壞死、截肢，甚至危及生命。臨床上四肢手術(shù)使用止血帶止血時肢體也有血循環(huán)中斷和復(fù)流過程，與缺血再灌注生理病理過程相似。因此設(shè)法減輕肌肉缺血壞死程度有很大的臨床意義。

細胞凋亡是骨骼肌缺血再灌注損傷的重要病理改變[3]。Fas 蛋白具有很強的凋亡誘導(dǎo)作用，它廣泛存在于各種組織和器官，具有介導(dǎo)細胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，維持自身穩(wěn)定作用。有研究表明[4]，細胞凋亡傳導(dǎo)信號顯著由腫瘤壞死因子（TNF）家族Fas，TNF 相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apopto sis-inducing ligand，TRAIL）激活。Fas 和TRAIL 這一凋亡誘導(dǎo)因子，將死亡信號傳遞至胞內(nèi)激活半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[5]。而且Fas 系統(tǒng)誘導(dǎo)細胞凋亡與Bcl-2的低表達相偶聯(lián)。

Bcl-2 屬抗凋亡亞族，它的蛋白分子C 端的羧基具有疏水性，含有一個由19個氨基酸伸展形成的跨膜結(jié)構(gòu)，常位于線粒體膜，對維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性起重要作用，它可調(diào)節(jié)線粒體通透性粒轉(zhuǎn)換孔道，阻止C-myc（一種原癌基因）介導(dǎo)的凋亡，抑制與還原型谷胱甘肽含量下降相關(guān)的凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)Bcl-2 基因表達增加，可誘導(dǎo)抗凋亡，產(chǎn)生保護機制[6]。

參麥注射液主要含有人參皂苷、人參多糖、甾苷、有機酸等成分，這些有效成分能加強機體器官抗應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)和促進機體免疫能。中醫(yī)認為，其通過扶助正氣，達到正氣盛而邪有所制，所謂“扶正祛邪”。人參皂苷具有抗應(yīng)激、抗氧化、抗缺血等作用，參麥注射液通過減少c-fos 基因的表達、調(diào)節(jié)血小板源生長因子（PDGF）、顯著增加Bcl-2 基因表達、減少細胞凋亡數(shù)目，保護腦損傷[7]。

本實驗觀察到，骨骼肌組織缺血再灌注時，肌纖維細胞受到破壞。與假手術(shù)組相比，模型組Fas 表達顯著增高（P＜0.01），而抗凋亡基因Bcl-2 表達亦增高（P＜0.01）；參麥注射液治療后明顯優(yōu)于模型組、假手術(shù)組，Bcl-2 表達明顯高于模型組（P＜0.05），F(xiàn)as 表達明顯低于模型組（P＜0.05），表明參麥注射液能夠促進抑制凋亡基因Bcl-2 表達，抑制促進凋亡基因Fas表達，調(diào)節(jié)各凋亡基因之間的平衡，提高骨骼肌對長時程缺血的耐受性，減輕骨骼肌缺血再灌注損傷的程度，保護骨骼肌細胞并改善其功能紊亂的作用。

參麥注射液對防治骨骼肌缺血再灌注損傷的療效值得肯定，但骨骼肌缺血再灌注組織損傷的機制是一個多因素參與的復(fù)雜過程，參麥注射液如何在各發(fā)病環(huán)節(jié)發(fā)揮干預(yù)和調(diào)節(jié)作用，還有待于進一步研究。

［1］Zingarelli B.Ischemia-reperfusion injury［A］.In:Wheeler DS，Wong HR，Shanley TP，eds.Science and Practice of Pediatric Critical Care Medicine［M］.London:Springer-Verlag，2009：181-192.

［2］吳學軍，夏英慧，林向全，等.再植和移植手術(shù)后血管危象治療的臨床體會［J］.中華顯微外科雜志，2011，34（1）：65-66.

［3］Wang WZ，F(xiàn)ang XH，Stephenson LL，et al.Ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in the cells isolated from rat skeletal muscle［J］.J Orthop Res，2008，26（3）：351-356.

［4］Andera L.Signaling activated by the death receptors of the TNFR family［J］.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olo mouc Czech Repub，2009，53（3）：173-180.

［5］Koide N，Morikawa A，Tumurkhuu G，et al.Lipopolysaccharide and interferon-γ enhance Fas-mediated cell death in mouse vascular endothelial cells via augmentation of Fas expression［J］.Clin Exp Immunol，2007，50（3）：553-560.

［6］Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2005，37（11）：719-727.

［7］Cheng JY，Huang JC，Liu GY，et al.Effect of shenmai injection on the expression of hippocampal c-fos gene of rats with ischemic cerebral injury［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2005，9（32）：228-229.