口腔黏膜白斑上皮組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)研究

滿一 沈國(guó)華 鐘良軍

白斑是公認(rèn)的最常見的癌前病變之一，上皮過度增生或不典型增殖是其特點(diǎn)，是上皮細(xì)胞數(shù)量由單純?cè)黾酉蚣?xì)胞質(zhì)量癌變轉(zhuǎn)化的中間階段，在這個(gè)轉(zhuǎn)變過程中不僅有細(xì)胞的過度增殖，同時(shí)還存在細(xì)胞凋亡異常，凋亡失控在細(xì)胞惡變的起始過程發(fā)揮作用［1，2］，近年來Bcl-2凋亡家族中的Bax蛋白在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化早期階段中的抑癌作用受到重視［3］，但此類研究報(bào)道筆者較少見。本研究通過觀察分析口腔白斑中Bax蛋白的表達(dá)狀況，探討口腔黏膜上皮惡變轉(zhuǎn)化中Bcl-2蛋白生物學(xué)行為，有助于臨床早期診斷和防治。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇2007年4月至2009年6月中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院保存的的石蠟切片54例，其中正常口腔黏膜25例，白斑29例;所有檢材診斷和組織學(xué)均依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，由同1名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家完成。

1．2 試劑 所有試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。Bax為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復(fù)合物MaxVisionTM為快捷即用型。DAB顯色試劑盒為鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HPR)免疫組化染色EnVision系統(tǒng)，適用于鏈霉素-過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色方法(streptavidin-peroxidase，SP)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化SP法染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡與增值狀況。所有組織切片經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋。5 μm連續(xù)切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規(guī)組織切片脫蠟入水;微波加熱10 min暴露抗原;過氧化物酶溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS水沖洗，鼠抗人即用型Bax抗體37℃孵育60 min，加入SP復(fù)合物HRPMarVisionTM，30℃孵育60 min;加入SP復(fù)合物HPR，4℃過夜;DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10 min，顯色后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，封片。以PBS(0．01 mol/L，pH值 7．4)代替一抗為陰性對(duì)照，胃癌陽性染色切片為Bax的陽性對(duì)照(福州邁新生物技術(shù)公司提供)。

1．4 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用HM2A8-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每例每張切片各隨機(jī)選取2～5個(gè)不重復(fù)、不重疊400倍高清視野，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染成棕色或棕紅色顆?；驈浡善瑺顬锽ax的陽性表達(dá)。計(jì)數(shù)切片中1 000個(gè)上皮基底細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。參照文獻(xiàn)［2］標(biāo)準(zhǔn)，將Bax定級(jí)為:陽性反應(yīng)為棕色到棕紅色顆?；蚱瑺顝浬⒍ㄎ挥诎麧{，高倍鏡下計(jì)數(shù):標(biāo)本中無陽性細(xì)胞為0分，＜25%為1分;26～50%為2分;50%以上為3分，最后求其平均數(shù)。染色強(qiáng)度以棕色為1分;深棕色為2分;棕紅色為3分。兩者相乘，0分為陰性(－);1～3分為弱陽性(+);4～6分為中等陽性(++);7～9分為(+++)。計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，PI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件，病變組織與對(duì)照組中陽性表達(dá)率以及各種臨床指標(biāo)中的表達(dá)率的的的差異采用χ2檢驗(yàn);樣本數(shù)＜40，癌前病變Bcl-2、Bax陽性表達(dá)率之間的相關(guān)性，白斑、扁平苔蘚之間的bcl-2、bax陽性表達(dá)率的差異采用Fisher精確概率法單因素相關(guān)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究的檢材組織類型涵蓋了口腔黏膜癌前病變發(fā)展所經(jīng)歷幾個(gè)階段:正常上皮組織、單純性增生、不典型增生，最終發(fā)展為原位癌。

2．1 Bax蛋白表達(dá)定位 正常口腔黏膜上皮組織的陽性細(xì)胞主要分布在角化層和粒層，點(diǎn)狀散在型分布為主;單純?cè)錾M織中的陽性細(xì)胞多位于上皮棘層，部分基底層也見陽性反應(yīng)性，周圍型分布為主;而不典型增生的上皮組織中以基底層陽性染色居多，主要定位于基底細(xì)胞胞質(zhì)中，個(gè)別病例在胞核中也有表達(dá)，貫穿上皮全層，多數(shù)局灶性分布。Bax在各種上皮組織中的表達(dá)情況見表1。見表1、圖1～4。

表1 Bax蛋白在口腔正常黏膜、白斑上皮細(xì)胞中的表達(dá) 例

2．2 Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)度 在正?？谇火つど掀そM織中的Bax陽性細(xì)胞主要分布在角化層和粒層，但染色較淡，呈黃棕色，陽性表達(dá)率40．00%。上皮單純?cè)錾鶥ax陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度加深，陽性細(xì)胞在上皮全層均可見，棕色和棕紅色顆粒、棕紅色顆粒，彌散分布，隨著增殖程度的增加，隨著上皮異常增生程度的加重，Bax表達(dá)逐漸增強(qiáng)，不典型增生上皮中分布最廣，貫穿上皮全層，整體染色強(qiáng)度也增強(qiáng)，以基底層中細(xì)胞質(zhì)著色最深。Bax在在各種上皮組織中的表達(dá)情況見圖1～4。

圖1 單純?cè)錾蠦ax的表達(dá)與分布(SP×100)

圖2 不典型增生中Bax的表達(dá)與分布(SP×100)

圖3 正?？谇火つど掀ax表達(dá)與分布(SP×100)

2．3 Bax蛋白表達(dá)形式 (1)彌散型:組織內(nèi)多數(shù)上皮細(xì)胞全層都有陽性表達(dá);(2)周圍型:主要是在組織周邊的基底層細(xì)胞有陽性表達(dá);(3)局灶型:上皮基底層、棘層、顆粒層內(nèi)有2～6個(gè)陽性細(xì)胞組成的局灶。

3 討論

Bax蛋白是在白細(xì)胞基因文庫中發(fā)現(xiàn)的21 kD Bcl-2同源蛋白，因 RNA 剪方式的不同編碼 3種蛋白:Baxα、Baxβ、Baxγ。其中Baxα為跨膜蛋白，可與Bcl-2α結(jié)合異二聚體Bcl-2/Bax，或形成同種二聚體Bax/Bax，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)嚴(yán)格依賴于二者的化學(xué)計(jì)量。

Bax蛋白免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析:25例正常口腔黏膜有10例出現(xiàn)了Bax陽性表達(dá)，主要分布在角化層、粒層等基底上層，弱染色染色為主;23例上皮單純?cè)錾栃约?xì)胞19例，陽性染色多位于上皮棘層、顆粒層，部分基底層也見陽性反應(yīng)細(xì)胞，分布形式上以周圍型為表現(xiàn)特征，染色強(qiáng)度加深;不典型增生上皮增殖中陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度深，以基底層陽性染色居多。無論單純?cè)錾€是不典型增生白斑組織中的Bax蛋白均顯過度表達(dá)，顯著高于正?？谇火つ?，但白斑各時(shí)期上皮組織之間的Bax蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

正?？谇火つど螧ax蛋白陽性細(xì)胞位于基底上層，并且呈點(diǎn)狀散在分布，這符合黏膜上皮細(xì)胞分裂起源于基底層并逐漸向角化層移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。而當(dāng)上皮出現(xiàn)異常增生時(shí)，特別不典型增生時(shí)，Bax蛋白的表達(dá)隨著增生強(qiáng)度改變而強(qiáng)化，強(qiáng)陽性染色細(xì)胞大多集中在上皮基底層，這種Bax蛋白表達(dá)隨著上皮增生強(qiáng)度改變而發(fā)生的波動(dòng)提示機(jī)體為了抑制過度生長(zhǎng)的細(xì)胞群體而采取了自穩(wěn)定機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，鼻咽癌組織中的Bax蛋白表達(dá)較慢性鼻咽炎組織的免疫反應(yīng)明顯減弱，鼻咽癌中促凋亡基因受到抑制［4］。Baldve等［5］研究發(fā)現(xiàn)鱗癌中的Bcl-2蛋白免疫反應(yīng)強(qiáng)烈，Bcl-2蛋白具有拮抗Bax蛋白作用，在鱗癌階段Bax蛋白表達(dá)降低。由此可見，當(dāng)增生性質(zhì)的改變時(shí)，若細(xì)胞獲得惡性表型，Bax蛋白可能失去作用或部分失去作用，腫瘤細(xì)胞自發(fā)的凋亡可能不再增加，細(xì)胞增殖加快。因此，在上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化階段，Bax蛋白表達(dá)的異常增高是白斑惡變的早期階段自我免疫反應(yīng)，體現(xiàn)了機(jī)體為抑制過度生長(zhǎng)的細(xì)胞群體，新生細(xì)胞開始啟動(dòng)了細(xì)胞自穩(wěn)定機(jī)制，試圖通過Bax/Bax蛋白表達(dá)的強(qiáng)化，促進(jìn)異常增殖細(xì)胞的凋亡，維持細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定，細(xì)胞凋亡能除去一些有基因突變的細(xì)胞，阻止惡性轉(zhuǎn)錄，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生副調(diào)控作用，使腫瘤發(fā)生的時(shí)間延遲。在不典型增生后期，則是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化加速階段，通過Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)化加速一些分裂周期短、增殖快，具有顯著惡變表型的異質(zhì)細(xì)胞凋亡。另一方面，Bax蛋白對(duì)分裂周期長(zhǎng)、增殖慢但具有高侵襲力、尚處在潛伏期的腫瘤細(xì)胞的免疫麻痹，喪失清除能力，維持潛在腫瘤細(xì)胞增殖率，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生存周期過長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞聚集造成細(xì)胞爆發(fā)式惡變，其保留的惡性細(xì)胞具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)也說明，細(xì)胞凋亡抑制因子如Bcl-2，可以作為癌基因，或者說細(xì)胞是凋亡的促進(jìn)因子如Bax，可以作為腫瘤抑制因子，如果敲除了具有促凋亡活性基因的大鼠腫瘤的發(fā)病率升高，則提示這個(gè)基因具有抑癌功能［6］。關(guān)于細(xì)胞數(shù)目自穩(wěn)定啟動(dòng)機(jī)制，Adams［6］認(rèn)為除 Bax、Bcl-2 和 Bak，在 Bcl-2 凋亡蛋白家族中還有一個(gè)單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白，單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白Bim、Bmf能夠與線粒體膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用。其活性通過轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)、翻譯后磷酸化、細(xì)胞骨架扣押等機(jī)制調(diào)節(jié)，從而結(jié)合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］，當(dāng)接到凋亡信號(hào)后，Bax與Bak在線粒體外膜聚集，形成允許細(xì)胞色素C通過的通道。在正常細(xì)胞中，Bim、Bmf被分別扣押在微管和肌球蛋白而保持無活性狀態(tài)，caspase8可以裂解激活Bid，磷酸化可以調(diào)節(jié)Bax的活性。

在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中，不典型增生的Bax蛋白陽性率高于單純?cè)錾?，而?xì)胞獲得惡性表型，促凋亡基因受到抑制，癌細(xì)胞的凋亡受阻，可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素，說明細(xì)胞惡變發(fā)生過程中存在促凋亡與凋亡抑制的相互傾軋傾向［8］。以往的研究偏重于細(xì)胞增殖在腫瘤形成中的作用，實(shí)際上細(xì)胞凋亡和增殖的平衡是決定細(xì)胞最終表型的重要因素。從細(xì)胞凋亡的機(jī)制出發(fā)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究，對(duì)抓住有效治療時(shí)期，減少后期惡變的可能性或消除化療藥物的不良反應(yīng)，對(duì)臨床檢測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸，預(yù)防癌變的發(fā)生有指導(dǎo)意義。

1 Gottschalk AR，Boise LH．Bcl-xL and Bcl-2 repress a common pathway of cell death．J Exp Med，1994，91:7350-7354．

2 Schimmer AD，Welsh K，Pinilla C，et al．Small-molecule antagonisys of apoptosis suppressor exhibit broad anti-tumor activity．Vancer cell，2004，5:25-35．

3 Eischen CM，Roussel MF，Korsmeyer SJ，et al．Bax loss impairs Mycinuced apoptossis and circumvents the selection of p53 mutations during Myc-mediated lymphomagenesis．Mol Cell Biol，2001，21:7653-7662．

4 王茂鑫．鼻咽癌組織中凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)及意義．貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，6:214-216．

5 Baldve B，F(xiàn)rancis WS，Bryan Whitatker，et al．Immunohistochemical evalution of bcl-2 oncoprotein in oral dysplasia and carcinoma．Oral Surg O-ral Med Pathol，1988，85:692-697．

6 Adams JM．Ways of dying:multiple pathways to apoptosis．Genes Dev，2003，17:2481-2495．

7 Villunger A，Michalak EM，Coultas L，et al．P53-and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa．Science，2003，302:1036-1038．

8 Yin C，Knudson CM，Korsmeyer SJ，et al．Bax suppression tumorigensis and stmulates apoptosis in vivo．Nature，1997，385:637-640．