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    花椒總生物堿抑菌作用

    2013-11-06 08:07:40邵建明王冠蕾
    關(guān)鍵詞:黑曲霉濾紙生物堿

    謝 輝,邵建明,王冠蕾

    (承德石油高等專科學(xué)?;瘜W(xué)工程系,河北承德 067000)

    花椒(Zanthoxylum BungeanumMaxim)是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylumlinn)植物花椒或青椒的成熟干燥果皮,具有溫中助陽,散寒燥濕,行氣止痛,殺蟲止癢和抗氧調(diào)味的功能,是我國傳統(tǒng)調(diào)味料和中藥[1]。經(jīng)測定花椒含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、脂肪酸及黃酮等化學(xué)成分[2]。

    目前對花椒提取物的藥理學(xué)活性研究主要集中在其揮發(fā)油和生物堿等方面,藥理實驗證明花椒揮發(fā)油具有較強的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、殺病菌和防霉菌作用,對農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾、桃蚜和楊毒蛾等亦有防治效果[3-6];花椒生物堿在抑制血小板凝集、抗瘧疾、鎮(zhèn)痛、止癢和抑制口腔致病菌等方面均顯示了一定生物活性[7],這些研究暗示著花椒中化學(xué)成分在作為天然藥物、化妝品、食品添加劑和生物農(nóng)藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本文以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉為受試菌株,對花椒總生物堿的抑菌活性進(jìn)行研究,以期進(jìn)一步明確花椒生物堿的抗菌譜,為花椒在醫(yī)藥、食品防腐上的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1菌種

    大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    真菌培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基):馬鈴薯浸出液200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH自然。

    細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH7.2 ~7.5。

    1.2 方法

    1.2.1 花椒總生物堿的提取[8]

    市售花椒粉碎后干燥至恒重,稱取粉末200 g,加入70%乙醇,料液比1∶10,用稀鹽酸調(diào)pH至3,60℃冷凝回流提取3 h。過濾后減壓回收乙醇,水提液用氨水調(diào)pH至9~10,再用氯仿萃取水層至水層對碘化鉍鉀反應(yīng)呈陰性,合并氯仿液,減壓濃縮后常溫晾干得花椒總生物堿1.04 g,用20%甲醇水溶液超聲溶解配制成500 mg/mL的花椒總生物堿溶液,過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆?/p>

    1.2.2 濾紙片法測定抑菌圈直徑[9]

    將活化培養(yǎng)的不同菌種制成菌懸液,然后加入0.2 mL菌懸液至冷卻的相應(yīng)培養(yǎng)平板中,涂布均勻。將直徑6 mm濾紙片浸入500 mg/mL的花椒總生物堿溶液中稍晾干后放入培養(yǎng)皿,對照為浸入20%甲醇水溶液的濾紙片,使濾紙片與培養(yǎng)基完全接觸。供試菌種平行接種3個培養(yǎng)平板。所有平板置培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h,霉菌于28℃培養(yǎng)48 h,酵母于30℃培養(yǎng)24 h,取出觀察,游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑(含濾紙片直徑),求平均值。

    1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定[10]

    采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度,取若干滅菌試管,以適合菌種生長的液體培養(yǎng)基將花椒總生物堿溶液進(jìn)行一系列對倍稀釋,濃度分別為 250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,3.91,1.95 mg/mL,同時設(shè)空白對照和甲醇溶液對照。加入相應(yīng)供試菌懸液0.05 mL至各試管。所有試管置培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h,霉菌于28℃培養(yǎng)48 h,酵母于30℃培養(yǎng)24 h,取出觀察判定結(jié)果,以含藥量低且肉眼觀察無可見菌生長的試管含藥量為藥物對該菌的MIC。

    1.2.4 熱處理對花椒總生物堿抑菌活性的影響[9]

    以大腸桿菌為指示菌,將500 mg/mL花椒總生物堿分別置40,60,80,100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理30 min,對照置于25℃,用濾紙片法來測定其抑菌圈直徑,試驗重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 花椒總生物堿的抗菌譜

    花椒總生物堿對供試菌種的抑制作用測定結(jié)果如表1所示,從表1中可以看出,花椒總生物堿對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉均具有一定的抑制效果;對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用較強,對釀酒酵母和黑曲霉的抑制作用稍弱。

    表1 花椒總生物堿的抑菌直徑

    2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

    花椒總生物堿對五種供試菌種的最小抑菌濃度測定結(jié)果如表2所示,從表2中可以看出,花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL,對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL,對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL,對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL,這表明花椒總生物堿對細(xì)菌的抑制作用較強,對酵母的抑制效果相對較弱。

    表2 花椒總生物堿對供試菌的最小抑菌濃度測定

    2.3 熱處理對花椒生物堿抑菌活性的影響

    以大腸桿菌為指示菌,測定不同溫度處理后花椒總生物堿的抑菌活性變化如圖1所示,由圖可知,花椒總生物堿經(jīng)過不同溫度處理后,其對大腸桿菌的抑菌圈直徑變化不大,經(jīng)過121℃濕熱處理后仍具有較高的抑菌活性,這表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

    3 結(jié)論

    借助濾紙片法,以抑菌圈直徑大小為評價標(biāo)準(zhǔn),對花椒總生物堿的抑菌作用進(jìn)行分析,結(jié)果顯示花椒總生物堿對細(xì)菌,釀酒酵母和黑曲霉具有抑菌作用,表明花椒總生物堿的抗菌譜較寬,花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL,對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL,對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL,對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL。熱穩(wěn)定性實驗表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

    [1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第四十三卷第二分冊[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

    [2] 畢君,曹福亮.花椒屬植物化學(xué)有效成分與開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā),2008,22(3):9-13.

    [3] 崔俊,李孟樓.花椒開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā),2008,22(2):9-14.

    [4] 干信,吳士筠,高雯琪.花椒揮發(fā)油抑菌作用研究[J].食品科學(xué),2009,30(21):128-130.

    [5] 趙媛.青花椒提取物對桃蚜和小菜蛾的生物活性研究[D].石家莊:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

    [6] 弭向輝.花椒揮發(fā)油的提取分離及其抗菌和抗腫瘤作用研究[D].南京:南京師范大學(xué),2004.

    [7] 石雪萍,關(guān)榮琴,張鳴鏑,等.花椒屬植物生物堿研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源,2010,29(4):1-7.

    [8] 貝玉祥,董秀華,李干鵬,等.紫堇中總生物堿體外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究[J].食品科技,2008(4):189-191.

    [9] 江潔芳.花椒中抑菌活性成分提取工藝的研究[J].中國調(diào)味品,2011,36(3):30-32.

    [10] 趙東亮,郁建平,周曉秋,等.博落回生物堿的抑菌作用研究[J].食品科學(xué)2005,26(2):45-47.

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