蛋白餌劑對橘小實蠅雌蟲生殖系統(tǒng)的影響

楊莉莉，王 波，陳家驊，袁燕舞

(福建農(nóng)林大學 益蟲研究所，福建 福州 350002)

橘小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)，又稱果蛆、東方實蠅，屬雙翅目(Diptera)實蠅科(Tetriphitidae)，該蟲為雜食性害蟲，寄主范圍廣，可危害柑橘、番石榴、楊桃、茄子、辣椒、瓜類等46個科250多種果樹、花卉和蔬菜，目前給我農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［1］。由于長期單一地使用化學方法防治，我國橘小實蠅田間種群的抗藥性問題已嚴重突顯［2－3］。因此，借助生防手段防控實蠅十分必要。

蛋白質(zhì)和糖是實蠅生長發(fā)育過程中兩個不可缺少的營養(yǎng)源，實蠅在羽化后必須取食蛋白才能達到性成熟［4］。利用這一特點開發(fā)應用蛋白餌劑現(xiàn)今已成為國內(nèi)外防控實蠅類害蟲的一項重要的生防措施［5－6］。目前對蛋白餌劑的研究多數(shù)集中在對水解蛋白液的工藝研究及實蠅的生物測定等方面［7－8］，一些關(guān)于蛋白餌劑引誘作用原理的研究主要集中在溶液揮發(fā)性物質(zhì)的研究［9－12］。此外，實蠅發(fā)育過程中自身對營養(yǎng)的需求也是探究蛋白餌劑作用機理的重要方面。Allwood等［4］研究發(fā)現(xiàn)雌性橘小實蠅必須取食蛋白才能產(chǎn)下可育卵，未成熟的雌性一般要去寄主植物上尋找蛋白源，如細菌和其他的分泌液，雄性和成熟的雌性同樣需要蛋白。McQuate等［13］發(fā)現(xiàn)瓜實蠅和橘小實蠅種群數(shù)量的增加可能與花粉的消耗有關(guān)。Miller等［14］發(fā)現(xiàn)寄主水果氣味對產(chǎn)卵及未產(chǎn)卵的雌性實蠅的引誘效果相當，但蛋白氣味對未產(chǎn)卵的瓜實蠅雌蟲的引誘效果強于已產(chǎn)卵的雌蟲。另外，王波［15］研究發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍踪|(zhì)∶糖為1∶3時，橘小實蠅實驗種群產(chǎn)卵量達到最大。而關(guān)于蛋白如何影響橘小實蠅生殖生長的研究仍有待進一步深入。

本文主要通過解剖觀察橘小實蠅羽化后至性成熟這一期間雌蟲卵巢的發(fā)育情況及測定其產(chǎn)卵情況，探究蛋白對橘小實蠅生殖系統(tǒng)的作用。本研究主要包括蛋白對橘小實蠅卵巢個體大小生長和發(fā)育等級的影響及對其產(chǎn)卵情況的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源:供試橘小實蠅來自福建農(nóng)林大學益蟲研究所2002年建立的室內(nèi)大量飼養(yǎng)種群，于橘小實蠅產(chǎn)卵的前中期(12 d左右)采卵，孵化后用幼蟲飼料飼養(yǎng)，收集發(fā)育較一致的老熟幼蟲，化蛹后待其羽化前4 d左右，用適宜篩子過篩，收集個體大小較一致的蛹，放入養(yǎng)蟲籠中待其羽化。取羽化12 h內(nèi)的成蟲作為實驗用蟲。

飼養(yǎng)條件:溫度(25±1)℃，相對濕度(70±5)%，光周期為10D∶14L。

養(yǎng)蟲籠:材質(zhì)為不銹鋼骨架外罩100目尼龍網(wǎng)，規(guī)格為30 cm×30 cm×30 cm。

儀器:電子天平、體視顯微鏡(Leica M205C)、微型解剖剪、微型解剖鑷、微型解剖針、量筒、燒杯等。

試劑:氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈣等，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

人工飼料由本研究所提供;蛋白餌劑由本研究所提供;白糖系韓國進口白砂糖。

1.2 方法

1.2.1 食物處理 食物1:人工飼料。食物2:蛋白餌劑與白糖1∶3混配。食物3:水與白糖1∶3混配。

1.2.2 成蟲處理 將羽化后12 h的成蟲在測試籠中飼養(yǎng)，籠中分別放入食物1、食物2和食物3。養(yǎng)蟲籠上方放置一塊濕潤海綿，為實蠅提供水源?；\中食物需每2 d更換一次。

1.2.3 試劑配制 Ringer’s生理鹽水:①稱取氯化鈉 6.5 g、碳酸氫鈉 0.2 g、氯化鉀 0.14 g、磷酸二氫鈉0.01 g分別溶解在少量蒸餾水中，然后混合用蒸餾水稀釋至980 mL;②稱取取氯化鈣0.12 g溶解在20 mL蒸餾水中;③把氯化鈣溶液逐滴加入到溶液①內(nèi)，邊滴邊攪拌，以免產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。

1.2.4 蛋白餌劑對卵巢生長的影響 (1)卵巢解剖方法。根據(jù)賈源等［16］的方法并略作改進:將實蠅放入Ringer’s生理鹽水中解剖，于中胸側(cè)面后盾片與翅基交界處進針:左手持鑷夾住中胸固定蟲體，右手持剪將翅足剪除干凈;左右手各持一鑷，由翅基處夾住蠅翅然后拔除。移動蟲體使其腹面朝下，左手持鑷夾住中胸固定蟲體，右手持陣油后盾片正中刺破，延其縫隙向兩側(cè)撕裂并剝離，清除生殖器官周圍的消化系統(tǒng)和脂肪體，最后用生理鹽水漂洗1～2次。

(2)卵巢大小的測定。將處理好的卵巢放于體式顯微鏡下，使用Leica Application Suite V4.0系統(tǒng)拍攝照片，根據(jù)標尺測量并記錄卵巢面積。從3日齡開始每隔1 d測量一次，至15日齡結(jié)束。每個處理5個重復。

(3)卵巢發(fā)育等級的鑒定。通過使用Leica顯微鏡對不同日齡的卵巢拍照進行觀察，確定其發(fā)育等級。從3日齡開始每隔1 d測量一次，至15日齡結(jié)束。

肖鐵光等［17］根據(jù)橘小實蠅不同發(fā)育時期的卵巢小管形態(tài)、卵黃沉積情況和側(cè)輸卵管萼內(nèi)有無卵粒將卵巢發(fā)育程度分為以下5個級別:0級:發(fā)育前期。卵巢小管細短挺直且具有彈性，后期其端部稍有膨大，整個卵巢呈無色透明狀。Ⅰ級:卵黃沉積前期。在卵巢小管的基部有渾濁或有少量的卵黃沉積。Ⅱ級:卵黃沉積期。在卵巢小管的基部有一粒成熟的卵或具成型的沉積(卵室可見)，卵黃沉積達小管長度的1/2或以上。Ⅲ級:卵成熟及產(chǎn)卵盛期。卵黃沉積達卵巢小管長度的1/2以上，沉積豐滿;側(cè)輸卵管萼內(nèi)有一?；蚨嗔Ｂ选＂艏?產(chǎn)卵末期。在與側(cè)輸卵管交接處卵巢小管下折，其內(nèi)無沉積或僅殘留少許沉積;卵室之間縊縮呈現(xiàn)念珠狀。

1.2.5 蛋白餌劑對產(chǎn)卵情況的影響 (1)產(chǎn)卵量的測定。于11日齡時，將喂食不同食物的實蠅分裝入不同養(yǎng)蟲籠中，每籠雌雄各30頭，仍舊飼喂原來的食物。于08:00放入自制產(chǎn)卵器進行采卵，12 h后取出產(chǎn)卵器，將卵全部用水沖出并收集至注射器中，靜置30 min，統(tǒng)計并記錄產(chǎn)卵量。每隔2 d采集并測定一次，共測3次。每個處理3個重復。

(2)卵孵化率的測定。將采集到的卵平鋪到內(nèi)置濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每只培養(yǎng)皿鋪卵100粒，然后將培養(yǎng)皿放置于25℃的人工氣候箱中，48h后觀察并記錄未孵化的卵數(shù)。每個處理3個重復。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS(11.0)統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，對試驗數(shù)據(jù)進行單因素變量方差分析，并運用Tukey’s進行方差檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白對橘小實蠅卵巢生長的影響

2.1.1 蛋白對卵巢個體大小的影響 通過測量并記錄各組不同日齡雌蟲的卵巢面積，得到結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明實蠅羽化后的5 d內(nèi)取食蛋白和未取食蛋白之間卵巢面積的差異不顯著，7 d開始各組間差異顯著(P=0.00，F(xiàn)=545.04，df=2)。各組卵巢面積在性成熟前隨日齡增加依次增大，至11日齡達到最大，1、2、3 組分別為2.82、2.35，0.32 mm2，隨后均有不同程度的下降;11日齡時食物 1 組和 2組的卵巢面積是3日齡的10倍以上，食物3組僅是3日齡的1.4倍;11日齡時食物1組和2組的卵巢面積分別是3組的9倍和7倍。從結(jié)果也可以看到，食物1組和食物2組從5日齡至11日齡卵巢面積急劇增大;食物3組卵巢面積增大緩慢，7日齡至11日齡間甚至幾乎不增大。

表1 蛋白餌劑對橘小實蠅卵巢面積的影響Tab.1 The effects of protein bait on ovarian areas of B.dorsalis

圖1 蛋白餌劑對卵巢發(fā)育等級的影響Fig.1 The effects of protein bait on the ovarians’developmental level of B.dorsalis

圖2 蛋白餌劑對橘小實蠅產(chǎn)卵量的影響Fig.2 The effects of protein bait on the amount of spawned egg of B.dorsalis

圖3 蛋白餌劑對橘小實蠅孵化率的影響Fig.3 The effects of protein bait on the hatch rate of B.dorsalis

2.1.2 蛋白對卵巢發(fā)育等級的影響 通過解剖實蠅卵巢的發(fā)育情況，觀察到實蠅在羽化當天卵巢的發(fā)育等級為0級。將各組發(fā)育情況拍照并整理后得出圖2，從中可以看到:食物1組發(fā)育至Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的日齡數(shù)分別為5、7、11;食物2組發(fā)育至Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的日齡數(shù)分別為5、9、11;食物3組從5日齡至15日齡其卵巢發(fā)育等級一直停留在Ⅰ級。以上對比中可以看到:食物1組發(fā)育正常，11日齡發(fā)育至完全性成熟，有卵產(chǎn)生;食物2組Ⅱ級比食物1組遲緩2 d，其它階段發(fā)育基本一致;食物3組的卵巢等級發(fā)育十分緩慢，甚至幾乎不發(fā)育。此3組在15日齡時均未發(fā)育至Ⅳ級。

2.2 蛋白餌劑對橘小實蠅產(chǎn)卵情況的影響

2.2.1 蛋白餌劑對產(chǎn)卵量的影響 結(jié)果(圖2)表明:食物1組的橘小實蠅3次的產(chǎn)卵量分別為:(0.12±0.01)mL、(0.13 ±0.01)mL、和(0.14 ±0.01)mL，食物2 組的分別為:(0.11 ±0.01)mL、(0.12 ±0.01)mL、和(0.14 ±0.01)mL，食物3 組的產(chǎn)卵量為0。

2.2.2 蛋白餌劑對卵孵化率的影響 結(jié)果(圖3)表明:食物1組和食物2組的卵孵化率分別為(86.00±3.61)%和(84.33 ±3.51)%。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)和糖對實蠅的正常生長發(fā)育必不可少，如果實蠅不取食糖是無法存活的，但如果只取食糖同樣不能正常生長發(fā)育。

蛋白對實蠅的生殖生長尤其關(guān)鍵，從實驗結(jié)果看，雌蟲只取食糖不取食蛋白卵巢個體大小幾乎不變，5日齡后遠遠小于正常發(fā)育的卵巢，后期無法形成正常大小的卵巢;發(fā)育等級也停滯在Ⅰ級，無法達至性成熟，因此無法產(chǎn)卵。取食糖+蛋白的實蠅與取食人工飼料的實蠅的卵巢發(fā)育較為一致，在性成熟的中后期卵巢迅速膨脹，為產(chǎn)卵做準備，且11日齡后兩組均可在卵巢內(nèi)形成正常的卵。另外，只取食糖不取食蛋白的橘小實蠅不能產(chǎn)卵，取食糖+蛋白與取食人工飼料的橘小實蠅均能產(chǎn)卵，且產(chǎn)卵量非常相近均在0.11 mL和0.14 mL之間，兩組卵的孵化率亦很相近均在85%左右。

從實驗的結(jié)果可以看到，取食糖+蛋白的橘小實蠅卵巢的整體發(fā)育狀況不如取食人工飼料的橘小實蠅:前者卵巢個體較小且與后者相比差異顯著，等級發(fā)育方面前者亦較緩慢。原因可能是實蠅卵巢的正常發(fā)育不是只要糖和蛋白就足夠，還要補充其他營養(yǎng)物質(zhì)，如脂類物質(zhì)等，至于其真正原因有待進一步研究。

［1］黃素青，韓日疇.桔小實蠅的研究進展［J］.昆蟲知識，2005，42(5):479 －484.

［2］潘志萍，曾玲，陸永躍.華南地區(qū)桔小實蠅對幾種農(nóng)藥的抗藥性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2005，26(4):23－26.

［3］章玉蘋，曾玲，陸永躍，等.華南地區(qū)桔小實蠅抗藥性動態(tài)監(jiān)測［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2007，28(3):20－23.

［4］Allwood A J，Vueti E T，Leblanc L，et al.Eradication of introduced Bactrocera species(Diptera:Tephritidae)in nauru using male annihilation and protein bait application techniques［C］.Proceedings of the International Conference on eradication of island invasives，1992:19 －25.

［5］Stenier L F.Fruit fly control in Hawaii with poison bait sprays containing protein hydrolysates［J］.J Econ Entomol，1952，45:838－843.

［6］杜迎剛，陳家驊，季清娥，等.一種新型蛋白誘劑對橘小實蠅引誘作用［J］.福建林學院學報，2007，27(3):259－262.

［7］王波，黃居昌，陳家驊.酶解啤酒廢酵母生產(chǎn)橘小實蠅蛋白餌劑的研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2010，32(2):299－302.

［8］王波.季清娥.陳家驊.橘小實蠅蛋白餌劑的生物測定［J］.云南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，25(4):483－486.

［9］Mazor M，Gothilf S，Galun R.The role of ammonia in the attraction of female of the Mediterranean fruit fly to protein hydrolysate baits［J］.Entomologia Experimentalis et Applicate，1987，43(1):25 － 29.

［10］Mazor M，Peysakhis A，Reuven G.Release rate of ammonia－a key component in the attraction of female mediterranean fruit fly to protein － based food lure［J］.IOBC wprs Bulletin，2002，25(9):323 －328.

［11］Epsky N D，Thomas D B，Serra C，et al.Ammonia as a component of fruit fly attractants［C］.National Entomological Society of America Annual Meeting，2007:13 －15.

［12］Tze － chuang Huang，Edward Y Cheng，Ching Hua Kao，et al.Area － wide control of the oriental fruit fly and melon fly in Taiwan［C］.The Proceeding of“Symposium on Taiwan － American Agricultural Cooperative Projects”，2008:147 －154.

［13］McQuate G T，Jones G D，Sulva C D.Assessment of corn pollen as a food source for two tephritid fruit fly species［J］.Environmental Entomology，2003，32(1):141 －150.

［14］Miller N W，Vargas R I，Prokopy R J，et al.State － dependent attractiveness of protein bait and host fruit odor Bactrocera cucurbitae(Diptera:Tephritidae)females［J］.Annals of the Entomological of Society of America，2004，97(5):1063 －1068.

［15］王波，季清娥，陳家驊，等.不同營養(yǎng)條件對橘小實蠅實驗種群生殖力及生命表的影響［J］.熱帶作物學報，2012，33(3):551－555.

［16］賈源，季偉華，謝醒民.家蠅顯微解剖方法的研究［J］.中國人獸共患病雜志，2004，20(12):1101－1103.

［17］肖鐵光，周社文，張佳峰，等.桔小實蠅卵巢發(fā)育及其應用［J］.作物研究，2009，23(4):273－274.