糖尿病大鼠心肌缺血預處理作用減弱與NO-cGMP信號通路抑制的關(guān)系

韓宏光，王輝山，韓勁松，汪曾煒，尹宗濤

缺血預適應(yīng)(IPC)是指經(jīng)歷了短暫性缺血后的心肌會對隨后發(fā)生的持續(xù)的、更為嚴重的缺血產(chǎn)生保護作用，目前被認為是最有效的一種心肌保護方式[1]。IPC對心肌的保護作用目前普遍認為與信號傳導機制有關(guān)，但確切機制尚待進一步深入研究。既往關(guān)于IPC的研究多數(shù)限于健康心肌，而對糖尿病心肌的研究較少。有研究表明，一氧化氮(NO)參與了急性期IPC[2]。本研究在既往血糖正常大鼠研究[3]的基礎(chǔ)上，應(yīng)用大鼠在體缺血再灌注模型，觀察糖尿病心肌IPC后NO、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)及一氧化氮合酶(NOS)含量的變化，為進一步深入研究IPC信號傳導機制尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康雄性SD大鼠購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，體重260～330g。腹腔注射鏈佐星(STZ，Sigma公司，60mg/kg)制作糖尿病大鼠模型，2d后測血糖≥11.1mmol/L為造模成功。所有大鼠飼養(yǎng)條件一致，2周后行動物實驗。NO、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，cGMP放免分析試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學同位素室。

1.2 在體左冠狀動脈阻斷模型的制備 10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射，麻醉成功后氣管插管，呼吸機輔助(呼吸機設(shè)定條件：潮氣量1.5ml/100g，呼吸頻率70～80次/min，吸呼比1:1.5)，心電監(jiān)測。逐層入胸，切開心包、懸吊，顯露左冠狀動脈，在左冠狀動脈下穿線，用聚乙烯小管穿過縫線兩端，拉緊小管并固定，制作心肌缺血模型，松開小管即為再灌注模型。左室前壁呈藍紫色或發(fā)紺、心電圖提示ST段抬高為缺血模型成功標志。實驗動物剔除標準：左室壁顏色、ST段改變不明顯以及出血較多者。

1.3 實驗分組 取糖尿病與血糖正常大鼠各30只，分別采用隨機數(shù)字法分為3組，每組10只。假手術(shù)(Sham)組：左冠狀動脈下穿線后，僅套環(huán)但不收緊小管，維持155min；缺血再灌注(I/R)組：左冠狀動脈下穿線后平衡35min，收緊小管，維持30min，再松開小管，維持90min；IPC組：左冠狀動脈下穿線后平衡35min，收緊小管，維持5min，再松開小管，灌注5min，重復進行3次，持續(xù)收緊結(jié)扎造成缺血30min，放松后再灌注90min。

1.4 各項指標檢測 采用全自動生化分析儀測定各組血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的含量。取心尖肌0.5g制成10%組織勻漿，采用TBA法測定MDA含量，鄰苯三酚自氧化法檢測SOD活性，放免法檢測cGMP含量，結(jié)果以pmol/g表示。采用硝酸還原酶法于波長530nm處測量心肌組織勻漿上清液吸光度(A)值，計算NO和NOS含量，結(jié)果用μmol/g prot和U/mg pro表示。

1.5 心肌線粒體Flameng評分 制作心肌組織電鏡切片，對線粒體進行Flameng評分[4]。方法：每組隨機觀察5個視野(每視野中20個線粒體)，計算每個視野中線粒體評分的平均數(shù)，5個視野的均值即為Flameng評分。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血糖濃度比較 制備的糖尿病大鼠血糖濃度為15.8±4.5mmol/L，非糖尿病大鼠血糖濃度為4.3±1.3mmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 血清CK、CK-MB和LDH含量變化 在非糖尿病大鼠，I/R組及IPC組血清CK、CK-MB、LDH含量均明顯高于Sham組(P＜0.05)，且I/R組明顯高于IPC組(P＜0.05)；在糖尿病大鼠，IPC組及I/R組CK、CK-MB、LDH含量明顯高于Sham組(P＜0.05)，而I/R組與IPC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1)。

2.3 心肌組織MDA、SOD含量比較 在非糖尿病大鼠，IPC組心肌MDA含量與I/R組比較明顯降低(P＜0.05)，SOD含量與I/R組比較明顯增高(P＜0.05)。而在糖尿病大鼠，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

2.4 心肌NO、cGMP、NOS含量比較 在非糖尿病大鼠中，與I/R組比較，IPC組心肌NO、cGMP、NOS含量明顯增加(P＜0.05)，而在糖尿病大鼠中，IPC組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3)。

2.5 線粒體超微結(jié)構(gòu)比較 非糖尿病大鼠IPC組Flameng評分(0.33±0.04)較Sham組(1.50±0.60)和I/R組(1.63±0.15)明顯降低(P＜0.05)；糖尿病大鼠IPC組Flameng評分(1.65±1.33)和I/R組Flameng評分(1.68±0.03)均高于Sham組(0.95±0.02， P＜0.05)，但IPC組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sham組及IPC組線粒體雙層膜存在，無明顯腫脹，胞核正常。非糖尿病IPC組線粒體中度腫脹，嵴稀疏、紊亂，核膜出現(xiàn)皺褶。糖尿病大鼠I/R組及IPC組線粒體重度腫脹，嵴稀疏、斷裂，呈空泡樣改變，核膜皺褶明顯(圖4)。

圖1 血清CK、CK-MB和LDH含量比較Fig.1 CK, CK-MB and LDH content in serum

圖2 心肌組織MDA、SOD含量比較Fig.2 MDA and SOD content in myocardial tissue

圖3 心肌NO、cGMP、NOS含量比較Fig.3 NO, cGMP and NOS content in myocardial tissue

圖4 線粒體超微結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparison of ultra-microstructure of the mitochondria

3 討 論

目前有關(guān)糖尿病對IPC的影響及其機制的研究較少。有研究表明，IPC在糖尿病大鼠心肌的保護作用受抑制可能與心肌胰島素抵抗有關(guān)[5-6]，但其機制可能不止一種。本研究通過在體左冠狀動脈阻斷模型探討IPC在糖尿病大鼠心肌的保護作用減弱與NO-cGMP信號通路的關(guān)系，結(jié)果顯示，在非糖尿病大鼠中，IPC后心肌組織SOD增加、MDA減少、心肌酶漏出減少，導致NO、cGMP、NOS含量明顯增加，而在糖尿病大鼠中，IPC后大鼠心肌酶漏出、MDA、SOD均無明顯差異，NO、cGMP、NOS含量亦未見明顯增加。Bandyopadhyay等[7]認為，I/R后氧自由基(ROS)生成過多，SOD含量降低，可導致MDA增加，膜脂質(zhì)過氧化，從而進一步加重心肌細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)IPC組大鼠心肌線粒體的損傷未較I/R組明顯減輕。因此，推測IPC在糖尿病大鼠心肌保護作用減弱可能與NO-cGMP信號通路在糖尿病心肌中的表達受到抑制有關(guān)。

目前，較為公認的IPC機制是細胞內(nèi)信號傳導途徑，一般分為觸發(fā)物質(zhì)、中介物質(zhì)和效應(yīng)子3個環(huán)節(jié)[8]。觸發(fā)物質(zhì)包括NO、前列腺素、腺苷、緩激肽等，中介物質(zhì)為蛋白激酶C(PKC)，效應(yīng)子主要為KATP通道。NO產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物質(zhì)可能是激發(fā)產(chǎn)生IPC的信號物質(zhì)，內(nèi)源性NO能與SOD競爭，滅活基礎(chǔ)狀態(tài)下產(chǎn)生的超氧自由基[9]。再灌注前予以NO供體，改善心肌收縮性，可縮小心肌梗死范圍[10]。Han等[11]研究證實NO-cGMP信號可以激活KATP通道。某些NO供體藥物能夠增強KATP通道及其開放劑如二氮嗪的活性[12]，這一作用是通過可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的激活使cGMP含量增加，再通過磷酸肌醇反應(yīng)以及激活cGMP依賴蛋白激酶兩條途徑激活PKC，導致KATP通道活化而實現(xiàn)的[13]。NO作為一種信號分子可通過cGMP-蛋白激酶途徑[14]降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，導致血管平滑肌松弛并阻止血小板聚集[15-16]、中性粒細胞黏附等。

高血糖可使線粒體生成超氧化物增多，后者可與NO發(fā)生化學反應(yīng)生成過氧化氮，從而降低NO的保護作用。高血糖狀態(tài)還可通過抑制內(nèi)皮型NOS使NO生成減少。糖尿病時由于糖異生作用加強，葡萄糖攝取和氧化功能發(fā)生障礙，細胞內(nèi)積聚大量甘油三酯和游離脂肪酸等脂滴顆粒，最終導致KATP通道活性降低。

總之，本研究推測IPC對糖尿病大鼠心肌的保護作用受抑制，其機制可能與NO-cGMP信號通路表達在糖尿病心肌中受到抑制有關(guān)，進而影響信號傳導中相關(guān)激酶或輔酶激活因子或KATP通道的活性，使IPC在糖尿病心肌中不能發(fā)揮有效的心肌保護作用。當然，糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠由于血糖存在的顯著差異，也可能對心肌代謝有一定影響，相關(guān)研究仍需進一步深入。

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