熒光法檢測(cè)鴨肉中新霉素殘留的研究

徐 將，劉木華，袁海超，肖海斌，趙進(jìn)輝，2*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)試驗(yàn)室，江西 南昌330045;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 南方農(nóng)業(yè)機(jī)械與裝備關(guān)鍵技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642)

新霉素(Neomycin，NEO)是一種氨基糖苷類抗生素，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，已經(jīng)被嚴(yán)禁使用。但是，部分養(yǎng)殖戶為了追求較高的利潤(rùn)，還是大量使用新霉素來(lái)預(yù)防和治療家禽、家畜的疾病。但是新霉素與同類抗生素類似，具有腎毒性和內(nèi)耳毒性，在家禽體內(nèi)大量地積聚，通過(guò)餐桌進(jìn)入消費(fèi)者的體內(nèi)，危害人們的身體健康。因此，對(duì)禽肉中新霉素殘留的檢測(cè)是十分重要的。許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)新霉素殘留限量均有規(guī)定，歐盟規(guī)定所有食品生產(chǎn)用肌肉中新霉素的殘留限量為5 μg/mL［1］?，F(xiàn)在對(duì)新霉素的檢測(cè)方法有很多，主要有微生物法［2－4］，HPLC［5－6］，ELISA［7－8］，光度法［9－12］，離子色譜法［13］，熒光顯微成像法［14－15］和熒光法［16－18］等。近年來(lái)，熒光法因?yàn)槠潇`敏度高，精確度好，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，引起研究人員的特別關(guān)注。李鋒等［19］以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化測(cè)定發(fā)酵液中硫酸新霉素的含量取得了滿意的結(jié)果。本研究中，采用熒光法來(lái)檢測(cè)鴨肉中殘留的新霉素。在乳化劑OP －10存在的環(huán)境下，利用新霉素中的氨基鍵與鄰苯二甲醛、巰基乙醇反應(yīng)，形成具有強(qiáng)熒光性的吲哚取代衍生物體系，在激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm 處取得最佳的檢測(cè)峰值，結(jié)果令人滿意。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用熒光法檢測(cè)鴨肉中新霉素殘留量的方法是可行有效的，并且操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便，為動(dòng)物源食品中氨基糖苷類抗生素的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)WARIAN 公司);JK－50B 型超聲波清潔器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司);FA1004 型電子天平(上海上平儀器有限公司);JJ－2B 型組織搗碎機(jī)(金壇市金南儀器廠);RE－52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和SHZ－ⅢD 型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

新霉素(購(gòu)自江西省食品藥品檢驗(yàn)所);鄰苯二甲醛;乳化劑OP－10(化學(xué)純);巰基乙醇;磷酸氫二鈉;檸檬酸;乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA);乙醇(液相色譜純)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 稱取25 mg 的NEO 標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入250 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容，配制成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，用超純水稀釋至所需的不同濃度。稱取13.4 mg 鄰苯二甲醛溶于1 000 mL容量瓶中，得到13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液;吸取140 μL 濃巰基乙醇溶液于100 mL 容量瓶中，用超純水稀釋，得到0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液;取100 mL 容量瓶，吸取10 mL 乳化劑OP－10 膠狀液體，用70 mL 乙醇稀釋，放入超聲振蕩器中振蕩30 min，取出等其溫度降低后，再用乙醇定容，得到乳化劑OP－10 溶液。分別取不同濃度的NEO 標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，依次加入13.4 mg/L的鄰苯二甲醛溶液1.5 mL，乳化劑OP－10 溶液1 mL，0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液2.5 mL，用超純水定容，搖勻，反應(yīng)90 min 后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.2 樣品制備 將1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液與625 mL 0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉溶液混合，得到Mcllvaine 緩沖溶液;稱取60.5 g 乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶于Mcllvaine 緩沖溶液中，加熱、搖勻，使其充分混勻，制成Mcllvaine－Na2EDTA 緩沖溶液。稱取2 g 絞碎的鴨肉樣品，置于25 mL 離心管中，加入8 mL 的Mcllvaine－Na2EDTA 緩沖溶液，搖勻，超聲振蕩10 min 后，以8 000 r/ min 的速度離心10 min，取上清液置于另一支25 mL 離心管中，殘?jiān)偌尤? mL 緩沖溶液重復(fù)提取一次，合并上清液，搖勻，加入5 mL 超純水，超聲振蕩15 min。然后以8 000 r/ min 的速度離心10 min，取出上清液，殘?jiān)僦貜?fù)提取一次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)－水浴烘干，加入1 mL 超純水。將樣品溶液通過(guò)濾膜過(guò)濾后，置于10 mL 棕色容量瓶中，依次加入13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液1.5 mL，乳化劑OP－10 溶液1 mL，0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液2.5 mL，用超純水定容，搖勻，反應(yīng)90 min 后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置和原理

如圖1 所示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置主要由熒光分光光度計(jì)和顯示器兩大部分組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將樣品倒入比色皿中，再將比色皿放入熒光分光光度計(jì)的樣品池中;如圖2 所示，儀器中的光路采用的是90°角透射進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)光直接照射在液體樣品上，調(diào)節(jié)激發(fā)光的波長(zhǎng)，使其達(dá)到可以激發(fā)被測(cè)樣品產(chǎn)生熒光的最佳強(qiáng)度，熒光檢測(cè)器在其直角方向檢測(cè)激發(fā)出來(lái)的熒光;通過(guò)Cary Eclipse 的分析軟件，在顯示器上顯示檢測(cè)樣品的光譜圖。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 Experimental apparatus

圖2 樣品池原理圖Fig.2 The sample cell diagram

1.4 儀器測(cè)定條件

檢測(cè)液載體為1 cm×1 cm 的石英比色皿，激發(fā)和發(fā)射光狹縫為5 nm，以激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm 的激發(fā)光掃描發(fā)射波長(zhǎng)為270 ～600 nm 段的熒光光譜，取熒光強(qiáng)度最強(qiáng)處的波長(zhǎng)為最佳發(fā)射波長(zhǎng)，新霉素的最佳發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)

如圖3 所示，新霉素準(zhǔn)品溶液的主要熒光峰在波長(zhǎng)400 ～500 nm 范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)證明，新霉素的發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm。為了得到最佳的熒光激發(fā)波長(zhǎng)，分別用320、330、340、350 和360 nm 的激發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)，在相同的濃度下，激發(fā)的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，說(shuō)明激發(fā)效果越好。結(jié)果顯示在發(fā)射波長(zhǎng)400 ～500 nm 范圍內(nèi)，用340 nm 的激發(fā)光去激發(fā)樣品時(shí)得到的熒光強(qiáng)度最佳。因此，本研究中激發(fā)光的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm。

圖3 新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)射光譜圖Fig.3 The emission spectrum of neomycin

圖4 熒光發(fā)射光譜圖:1.NEO;2.NEO 和鄰苯二甲醛、巰基乙醇反應(yīng)的反應(yīng)物;3.在乳化劑OP－10 環(huán)境下的反應(yīng)物Fig.4 Fluorescent emission spectra:1.NEO;2.the reactant of NEO，OPA and thioglycol;3.in the environment of Emulsifier OP－10

2.2 NEO 及其反應(yīng)物的熒光光譜

如圖4 中光譜曲線1 所示，NEO 自身幾乎不產(chǎn)生熒光，其和鄰苯二甲醛、巰基乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后，生成的反應(yīng)物可以產(chǎn)生熒光，如圖4 中光譜曲線2 所示，其熒光強(qiáng)度較弱，最佳激發(fā)波長(zhǎng)λex和發(fā)射波長(zhǎng)λem分別為340 nm 和436 nm;但是，在乳化劑OP－10 環(huán)境下，如圖4 中光譜曲線3 所示，該反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)近15.4 倍，同時(shí)λem位移到440 nm。

2.3 鄰苯二甲醛對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

NEO 與鄰苯二甲醛反應(yīng)，是該實(shí)驗(yàn)中最主要的過(guò)程，對(duì)熒光的強(qiáng)度有很大的影響。為考察其影響程度，取6 支10 mL 的容量瓶，依次加入除鄰苯二甲醛以外的各種試劑，100 mg/L 的新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液100 μL，0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液2.5 mL，乳化劑OP－10 溶液1 mL，然后分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mL 的13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液。用超純水定容，反應(yīng)90 min 后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。在同等濃度下，熒光強(qiáng)度最大的為最佳。如圖5 所示，鄰苯二甲醛的加入量為1.5 mL 的時(shí)候，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。因此在本次實(shí)驗(yàn)中，鄰苯二甲醛的最佳加入量為1.5 mL。

圖5 鄰苯二甲醛對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of OPA on fluorescence intensity

圖7 巰基乙醇對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of thioglycol on fluorescence intensity

圖6 乳化劑OP－10 對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of Emulsifier OP－10 on fluorescence intensity

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of reaction time on fluorescence intensity

2.4 乳化劑OP－10 對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

乳化劑OP－10 的存在可以減少熒光分子之間的相互碰撞，抑制其猝滅［20］。取4 支10 mL 容量瓶，依次加入100 mg/L 的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液2.5 mL，13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液1.5 mL，然后分別加入0.5、1.0、1.5 和2.0 mL 的乳化劑OP－10溶液。用超純水定容，反應(yīng)90 min 后，測(cè)其熒光強(qiáng)度，取熒光強(qiáng)度最大的為最佳條件。如圖6 所示，當(dāng)加入1 mL 乳化劑OP－10溶液后，熒光強(qiáng)度處于最大值，因此在實(shí)驗(yàn)中乳化劑OP－10 溶液的加入量為1 mL。

2.5 巰基乙醇的濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

巰基乙醇的濃度對(duì)NEO 和鄰苯二甲醛反應(yīng)物的穩(wěn)定性有很大的影響。取8 支10 mL 容量瓶，依次加入100 mg/L 的新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液100 μL，13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液1.5 mL，乳化劑OP－10溶液1 mL，然后分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0 mL 的0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液。用超純水定容，反應(yīng)90 min 后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。當(dāng)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)條件為最佳。如圖7 所示，加入巰基乙醇溶液后，熒光強(qiáng)度明顯降低了，呈下降趨勢(shì)，在加入量為2.5 mL 時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，因此在實(shí)驗(yàn)中，巰基乙醇溶液的取量為2.5 mL。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

取1 支10 mL 的容量瓶，依次加入100 mg/L 的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，13.4 mg/L 的鄰苯二甲醛溶液1.5 mL，乳化劑OP－10 溶液1 mL，0.02 mol/L 的巰基乙醇溶液2.5 mL。用超純水定容，反應(yīng)10 min，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，每隔10 min 對(duì)該樣品檢測(cè)一次，取熒光強(qiáng)度最大的反應(yīng)時(shí)間為最佳反應(yīng)時(shí)間。如圖8 所示，在反應(yīng)時(shí)間為90 min 的時(shí)候，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，因此在本次實(shí)驗(yàn)中，樣品的反應(yīng)時(shí)間取90 min。

2.7 工作曲線、檢測(cè)限、精密度

按照最佳的條件檢測(cè)NEO 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。如圖9 所示，隨著新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且呈良好的線性關(guān)系，得到工作曲線為:F =45.3C +9.7(R =0.984 9)，線性范圍為1.00 ～8.00 μg/mL，檢測(cè)限為1.0 μg/mL。配制10 份同一濃度的NEO 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照最佳條件進(jìn)行平行測(cè)定，其RSD 為1.31%。

圖9 新霉素標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig.9 The curve of neomycin standard

圖10 真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的關(guān)系圖Fig.10 The diagram of true value and predictive value

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果和加標(biāo)回收率

根據(jù)1.2 處理鴨肉樣品，對(duì)含有不同濃度新霉素殘留的鴨肉提取液進(jìn)行檢測(cè)。鴨肉提取液中新霉素含量的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值的關(guān)系如圖10 所示，其橫坐標(biāo)是鴨肉提取液中新霉素含量的真實(shí)的濃度，縱坐標(biāo)是鴨肉提取液中新霉素含量的預(yù)測(cè)的濃度。在濃度為1.00 ～8.00 μg/mL 范圍內(nèi)，真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間的關(guān)系方程為:y=0.976 9x+0.068 9，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。實(shí)驗(yàn)證明，該方法可以用于鴨肉中新霉素殘留的檢測(cè)，且效果較好。鴨肉提取液的模型是由殘留量的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值所建立的，并且建立模型的樣品數(shù)相對(duì)較少;而新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的模型是由熒光強(qiáng)度值和相對(duì)應(yīng)的濃度值建立的。所以和新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的模型相比，鴨肉提取液的效果更佳，這進(jìn)一步說(shuō)明了該方法是正確可靠的。

取市售鴨肉樣品，按實(shí)驗(yàn)方法1.2 制備樣品，檢測(cè)樣品后未發(fā)現(xiàn)NEO 殘留。對(duì)樣品進(jìn)行8 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率測(cè)定，結(jié)果如表1 所示，回收較完全，該方法是準(zhǔn)確可靠的。

表1 加標(biāo)樣品回收率Tab.1 Recoveries of spiked sample %

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鴨肉提取液中新霉素殘留的熒光光譜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，得出新霉素最佳的激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm;對(duì)新霉素溶液發(fā)射熒光光譜的實(shí)驗(yàn)原理及檢測(cè)新霉素溶液熒光強(qiáng)度的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明，當(dāng)加入1.5 mL 鄰苯二甲醛溶液，1 mL乳化劑OP－10 溶液和2.5 mL 巰基乙醇溶液，并且反應(yīng)90 min 后，熒光強(qiáng)度達(dá)到最佳;發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)在400 ～500 nm 范圍內(nèi)，含有新霉素殘留的鴨肉提取液比空白鴨肉提取液有明顯的變化，且在濃度為1.00～8.00 μg/mL 范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨新霉素殘留量的增大而增強(qiáng)，得到線性相關(guān)系數(shù)為0.984 9;對(duì)含不同濃度新霉素的鴨肉提取液進(jìn)行檢測(cè)，得到加標(biāo)回收率的平均值為99.69%，檢測(cè)限為1.00 μg/mL，達(dá)到了歐盟規(guī)定的食品生產(chǎn)用肌肉中新霉素的殘留限量。本實(shí)驗(yàn)利用熒光法來(lái)檢測(cè)鴨肉中新霉素的殘留具有便捷、靈敏性好的特點(diǎn)，該方法可為進(jìn)一步研究氨基糖苷類抗生素在動(dòng)物源食品中殘留的檢測(cè)提供幫助。

［1］歐盟食品中農(nóng)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn).獸藥殘留限量查詢［EB/OL］.2010 －08 －01.

［2］農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局.動(dòng)物源食品中新霉素殘留檢測(cè)方法—微生物學(xué)檢測(cè)法［J］.中國(guó)獸藥雜志，2002，36(11):11－12.

［3］王蘇華，周楊.雞蛋中新霉素殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法［J］.中國(guó)獸藥雜志，2003，37(2):16 －19.

［4］曹雨辰，田淑琴，韋田，等.微生物法檢測(cè)成都地區(qū)動(dòng)物源性食品的新霉素殘留［J］.西南民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，31(2):244 －248.

［5］陳蓉，付麗娟.HPLC 法柱前衍生法測(cè)定復(fù)方新霉素滴耳液中新霉素的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2004，5(3):48 －50.

［6］宋潔，王偉利，姜蘭，等.柱前衍生HPLC 法檢測(cè)羅非魚(yú)肌肉中的硫酸新霉素［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38(3):142－147.

［7］商艷紅，陳義強(qiáng)，吳小平，等.雞組織中新霉素殘留的ELISA 檢測(cè)方法的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2007，43(7):90－91.

［8］劉沙洲，桑小雪，歐陽(yáng)華學(xué)，等.新霉素ELISA 檢測(cè)方法的建立［J］.食品科學(xué)，2011，32(14):227－231.

［9］賴曉欣，梁純光，韓德忠.分光光度法測(cè)定硫酸新霉素滴眼液含量［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，10(4):182 －182.

［10］柳玲寶，屠一峰.熒光廣度法測(cè)定抗生素氧氟沙星［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000(2):800 －802.

［11］高紅，趙一兵，郭祥群.一種測(cè)定四環(huán)素類抗生素的光譜新方法［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(3):488 －490.

［12］倪永年，葛成相.多元校正分光光度法同時(shí)間測(cè)定兔血清中內(nèi)的β－內(nèi)酰胺類抗生素［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27(2):355 －359.

［13］官斌，袁東星.牛奶樣品中新霉素殘留量的離子色譜法測(cè)定［J］.分析試驗(yàn)室，2007，26(7):1 －4.

［14］劉穎，馮金朝，李丹，等.自組裝成環(huán)熒光顯微成像技術(shù)在抗生素殘留量檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(8):2217 －2221.

［15］劉穎，楊樂(lè).鎂敏化美他環(huán)素?zé)晒怙@微成像技術(shù)應(yīng)用于北京市密云縣養(yǎng)殖場(chǎng)生鮮乳抗生素殘留量的檢測(cè)［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30(5):1279 －1283.

［16］溫利鋒，馬天仲，榮舉，等.一種簡(jiǎn)便的綠色熒光蛋白和新霉素抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后克隆篩選方法［J］.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，24(2):110 －115.

［17］劉保生，閆瀟娜，種寶紅，等.利用銪(Ⅲ)－諾氟沙星－十二烷基硫酸鈉的光致發(fā)光及稀土敏化熒光法測(cè)定硫酸新霉素的濃度［J］.發(fā)光學(xué)報(bào)，2012，33(4):453 －457.

［18］王良，閆永勝，李華明，等.TCS－Fe(Ⅲ)體系離子液體氣浮浮選熒光光譜法分離/富集四環(huán)素類抗生素殘留的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30(2):391 －394.

［19］李鋒，邱小明，石賢愛(ài)，等.OPA 柱前衍生法測(cè)定硫酸新霉素的含量［J］. 福州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，35(1):130 －132.

［20］梁榕源，林竹光，蘇興平，等. 乳化劑OP/水－氯化銀體系光散射光譜應(yīng)用研究［J］. 福州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1999，27(Z1):142 －143.