ICC和Cx43參與半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱的作用機(jī)制*

★ 張燕 劉換新 梁敏燕 張宏 袁懷文 劉梅 葉春 邢德剛 (.武警廣東總隊(duì)醫(yī)院病理科 廣州 50507；.廣東藥學(xué)院生理學(xué)教研室 廣州 50006)

ICC和Cx43參與半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱的作用機(jī)制*

★ 張燕1**劉換新1梁敏燕1張宏1袁懷文1劉梅1葉春1邢德剛2(1.武警廣東總隊(duì)醫(yī)院病理科 廣州 510507；2.廣東藥學(xué)院生理學(xué)教研室 廣州 510006)

目的:探討ICC(interstitial cells of Cajal)和Cx43(Connexin43)在半夏瀉心湯治療豚鼠糖尿病胃輕癱的過(guò)程中所起的作用及其機(jī)制。方法：制備半夏瀉心湯含藥血清并建立糖尿病胃輕癱豚鼠模型。處死豚鼠并取材胃標(biāo)本后免疫組化染色標(biāo)記c-Kit和Cx43抗體，顯微鏡下觀(guān)察并比較實(shí)驗(yàn)各組豚鼠ICC和Cx43的數(shù)量及變化，并通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察ICC的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果: 半夏瀉心湯含藥血清能明顯增加糖尿病胃輕癱豚鼠ICC數(shù)量，并能修復(fù)其受損的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)論：ICC的數(shù)量顯著減少并發(fā)生變性是發(fā)生糖尿病胃輕癱的一個(gè)重要原因，半夏瀉心湯含藥血清能明顯增加豚鼠ICC的數(shù)量并修復(fù)其受損結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)豚鼠的胃動(dòng)力并恢復(fù)其功能，從而起到治療糖尿病胃輕癱的作用。

半夏瀉心湯；糖尿病胃輕癱；免疫組化；ICC；Cx43

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis syndrome,DGP)由Kassander于1958年首次提出這個(gè)概念，DGP的發(fā)病率大約有30%-50%，是糖尿病(DM)一個(gè)常見(jiàn)而重要的并發(fā)癥[1]，它不但引起消化道癥狀導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良和水電解質(zhì)紊亂，還可削弱血糖的調(diào)控，改變口服藥物的吸收,促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)研究表明其無(wú)論對(duì)在體胃腸運(yùn)動(dòng)還是離體胃腸運(yùn)動(dòng)均具有雙向性調(diào)節(jié)作用[2]。以往的臨床應(yīng)用表明，半夏瀉心湯被廣泛運(yùn)用于治療消化道運(yùn)動(dòng)障礙性疾病, 尤其是在治療胃腸功能性消化不良、糖尿病胃輕癱方面療效卓著[3，4]。本課題實(shí)驗(yàn)采用免疫組化標(biāo)記c-Kit和Cx43以及透射電鏡觀(guān)察ICC的超微結(jié)構(gòu)變化，觀(guān)察半夏瀉心湯對(duì)大鼠胃平滑肌的影響，并探討ICC和Cx43在半夏瀉心湯治療豚鼠糖尿病胃輕癱的過(guò)程中所起的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年EWG/B型豚鼠160只(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重250-350g之間,雌雄不限。

1.2 制備含藥血清

實(shí)驗(yàn)用中藥材購(gòu)自廣州市二天堂大藥房，給藥劑量依照人單位藥方水煎劑的生藥劑量比例按原著根據(jù)文獻(xiàn)折算(半夏瀉心湯組方由半夏55.78g、黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875g、黃連15.625g、大棗42g組成，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，擴(kuò)大10倍)。于煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5倍的冷水浸泡1小時(shí)，煮沸30分鐘，再加3倍量水繼續(xù)煎煮20分鐘，煎煮液濃縮后，制成濃縮液。按照劑量，每日分上、下午2次給藥。第3日全量給藥后頸總動(dòng)脈取血，立即注入無(wú)菌管中,室溫靜置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清離心,再吸取上清即為含藥血清。滅活30分鐘,用微孔濾膜過(guò)濾除菌，經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)微生物污染后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 建立糖尿病胃輕癱模型

將豚鼠隨機(jī)分為2組，糖尿病組120只，正常對(duì)照組40只。糖尿病組豚鼠給予2%鏈脲佐菌素溶液80mg/Kg，腹腔注射，1周后測(cè)尿糖、血糖。尿糖(+++)以上，血糖濃度≥11.1mmol/L，確定為糖尿病模型，不符合要求的豚鼠予以剔除。正常對(duì)照組給予腹腔注射等量的生理鹽水，血、尿糖正常。兩月后通過(guò)記錄色素胃排空和腸道傳輸速度，確定糖尿病胃輕癱模型成功建立。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

從糖尿病胃輕癱模型組豚鼠中挑選出80只，隨機(jī)分成2組，其中半夏瀉心湯給藥組40只，模型組40只，另設(shè)空白對(duì)照組40只。自糖尿病胃輕癱模型造模成功后第8天起半夏瀉心湯組豚鼠每日2次給予半夏瀉心湯藥液灌胃，每次給藥1mL/100g體重，連續(xù)服藥14天；空白對(duì)照組自由飲用水；模型組每日灌服生理鹽水2mg/100g體重，連續(xù)服用14天。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食24小時(shí)，飲水不限。實(shí)驗(yàn)時(shí)猛擊大鼠頭部致昏，迅速取材其全胃標(biāo)本，沿胃小彎剪開(kāi)胃，切成2×1.5×0.3cm3大小的組織塊，10%福爾馬林液固定，常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、石蠟切片、HE染色、中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組用藥后胃平滑肌細(xì)胞的病理形態(tài)改變。通過(guò)采用免疫組化標(biāo)記c-Kit和Cx43，透射電鏡觀(guān)察ICC的超微結(jié)構(gòu)等多種分子病理學(xué)技術(shù)，比較半夏瀉心湯含藥血清用藥后糖尿病胃輕癱動(dòng)物模型胃平滑肌細(xì)胞、Cajal間質(zhì)細(xì)胞和Connexin43的變化，從而探討其治療作用及機(jī)制。具體方法如下：(1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：使用即用型免疫組織化學(xué)超敏S-P試劑盒，采用ABC法染色。常規(guī)切取4μm切片，脫蠟至水,經(jīng)H2O2阻斷和抗原修復(fù)后嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，特異性標(biāo)記c-Kit和Cx43，觀(guān)察用藥后胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞和Connexin43的變化。(2)采用透射電子顯微鏡觀(guān)察ICC超微結(jié)構(gòu)的變化：包括ICC細(xì)胞之間、及與其他細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)、線(xiàn)粒體和細(xì)胞器的變化，染色質(zhì)及肌膜的改變等。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃竇組織中ICC和Cx43的數(shù)量和表達(dá)

采用免疫組織化學(xué) SP二步法測(cè)定。SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，試劑采用兔抗人c-Kit (Anti-Human CDll7)和Cx43單克降抗休。取10%中性甲醛溶液固定后的胃竇組織，脫水、透明、石蠟包埋、切片，染色方法按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)寫(xiě)的步驟進(jìn)行。每批染色均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)各取6個(gè)視野，通過(guò)HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)讀片和測(cè)量分析，c-Kit和 Cx43均以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。

1.7 制作電鏡標(biāo)本并觀(guān)察ICC超微結(jié)構(gòu)

將大鼠胃體組織剪切成1mm3小塊若干，置于2.5%戊二醛固定，0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次，1%四氧化鋨固定l小時(shí)。再用0.1mol/L的磷酸緩沖液PBS漂洗3次，乙醇、丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹(shù)脂(Epon)812包埋，聚合37℃24小時(shí)，48℃24小時(shí)，60℃48小時(shí)。超薄切片機(jī)切片，厚約60-70nm，200目銅網(wǎng)撈片，酒精醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，在日立H-600型透射電鏡下觀(guān)察，照相。每例標(biāo)本觀(guān)察20個(gè)以上銅網(wǎng)，觀(guān)察Cajal間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)和血管并隨機(jī)攝片。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模2個(gè)月后，糖尿病組大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)了明顯多飲、多尿、多食，大便性狀改變，大便干稀不等，精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，體態(tài)瘦小，皮毛稀疏無(wú)光澤，皮膚潰瘍明顯高于對(duì)照組；糖尿病組大鼠的平均體重 (203.4±39.2)g，明顯低于正常對(duì)照組大鼠(386.8±44.5)g；糖尿病組大鼠的血糖為(25.3±2.8)mmol/L，明顯高于正常對(duì)照組(4.6±0.6)mmol/L；糖尿病組大鼠的胃排空率為(62.6±4.7)%，顯著延遲于正常對(duì)照組(81.4±7.2)%，由此確定糖尿病胃輕癱模型建立成功。

2.2 胃ICC和Cx43的免疫組化表達(dá)情況

ICC的陽(yáng)性表達(dá)情況。

2.2.1 正常對(duì)照組

c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，密集地分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層和縱形肌層之間，主要集中于環(huán)形肌層內(nèi)及附近，肌間神經(jīng)叢之間和黏膜下內(nèi)環(huán)肌層表面也有密集的ICC分布，胃底肌間神經(jīng)叢未見(jiàn)ICC分布(圖1)。

2.2.2 糖尿病胃輕癱模型組

c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞分布密度明顯弱于對(duì)照組，非常稀疏地分布在環(huán)形、縱形肌層間，而且無(wú)環(huán)形肌層內(nèi)及附近主要分布的特點(diǎn)(圖2)。

2.2.3 半夏瀉心湯治療組

陽(yáng)性細(xì)胞同正常對(duì)照組一樣主要分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層內(nèi)及附近，數(shù)量較多(圖3)。

2.2.4 Cx 43的陽(yáng)性表達(dá)情況

對(duì)照組和半夏瀉心湯治療組Cx 43陽(yáng)性表達(dá)密集分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層中，陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)弱與ICC的陽(yáng)性分布具有一致性；糖尿病胃輕癱模型組 Cx43的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組。

2.3 胃ICC超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示。

2.3.1 正常對(duì)照組

大鼠胃ICC主要分布于胃竇環(huán)形肌與縱形肌之間的肌問(wèn)神經(jīng)叢周?chē)?，由許多縫隙連接緊密地連接在一起，ICC之間及其與平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞之間多見(jiàn)由緊密并置的質(zhì)膜形成的縫隙連接，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變不明顯(圖4)。

2.3.2 糖尿病胃輕癱模型組

胃竇ICC與其它的ICC、平滑肌和神經(jīng)末梢之間的縫隙連接均顯著減少，尚存的細(xì)胞問(wèn)連接的結(jié)構(gòu)也有破壞，結(jié)構(gòu)不清，連接松散且問(wèn)隙增大；ICC細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組；ICC細(xì)胞的基膜結(jié)構(gòu)不完整，缺乏連續(xù)性，有的基膜與細(xì)胞膜分離，形成空洞；ICC細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)廣泛溶解，有大量的胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，空泡大多沿質(zhì)膜分布；線(xiàn)粒體腫脹、空泡樣變、甚至溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有擴(kuò)張(圖5)。

2.3.3 半夏瀉心湯治療組

可見(jiàn)胃竇ICC與平滑肌和神經(jīng)末梢之間的縫隙連接均明顯增多，有較發(fā)達(dá)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體和高爾基體，偶見(jiàn)基底膜不完整、線(xiàn)粒體輕度腫脹；胃ICC的數(shù)量較胃輕癱模型組增多，較正常對(duì)照組稍減少。ICC形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞表面突起增多，可見(jiàn)細(xì)胞連接，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量較胃輕癱模型組增多，嵴清晰可見(jiàn)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，數(shù)量較多，表面核糖體顆粒均勻。大鼠胃竇部lCC的數(shù)量較模型組為多。胃ICC之間、ICC與平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)末梢間連接的病理?yè)p害較胃輕癱模型組輕，其結(jié)構(gòu)較清晰而緊密。壁內(nèi)神經(jīng)及Icc的分布及突起連接的病理?yè)p害較胃輕癱模型組為輕 (圖6) 。

3 討論

糖尿病胃輕癱(DGP)是近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，目前認(rèn)為它是一個(gè)多因素疾病，其具體病理生理機(jī)制尚不十分清楚。因此，研究中醫(yī)藥治療糖DGP的作用機(jī)制能為胃動(dòng)力障礙疾病的防治提供理論依據(jù)，具有重要臨床意義。消化道通過(guò)胃腸道平滑肌細(xì)胞的舒縮運(yùn)動(dòng)來(lái)完成對(duì)食物的機(jī)械性消化，并推動(dòng)食物的前進(jìn)。平滑肌細(xì)胞是胃腸道運(yùn)動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在80年代末，Bitar和Makhfou首先建立了測(cè)量豚鼠分離胃平滑肌細(xì)胞技術(shù)，許文燮等將其技術(shù)做出相應(yīng)調(diào)整，成功制備了豚鼠游離單個(gè)胃平滑肌細(xì)胞，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[5]。胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞((interstitial cells of Cajal，ICC)是一類(lèi)具有獨(dú)特功能的間質(zhì)細(xì)胞，由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家 Cajal于1893年首次發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞呈網(wǎng)狀分布在胃腸道神經(jīng)末梢與平滑肌細(xì)胞之間，對(duì)控制胃腸動(dòng)力功能起關(guān)鍵作用。ICC是胃腸慢波的起搏細(xì)胞,主要參與胃腸基本電節(jié)律(BER)調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),近年來(lái)進(jìn)行的一系列研究表明這種細(xì)胞在胃腸電及動(dòng)力發(fā)生和運(yùn)動(dòng)障礙機(jī)制中有重要作用[6]，研究證實(shí)ICC數(shù)量減少或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞可造成胃慢波消失或節(jié)律失常，胃排空延遲[7]。Jameson等[8-10]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者胃活體組織切片顯示ICC明顯減少，甚至缺失。ICC表達(dá)原癌基因c-kit，cKit表達(dá)一種受體酪氨酸激酶-CD117/c-Kit蛋白，它是干細(xì)胞因子(stem cell facter，SCF)受體，可被特異性的抗體檢測(cè)出來(lái)[11，12]。應(yīng)用針對(duì)c-kit的免疫組化標(biāo)記抗體可以特異性識(shí)別ICC[13]，在顯微鏡下觀(guān)察ICC的分布和密度。

ICC網(wǎng)絡(luò)與平滑肌細(xì)胞間通過(guò)縫隙連接(gap junctions)相連，其發(fā)揮生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Connexin43(Cx43)是最重要的縫隙連接蛋白。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病胃輕癱大鼠胃壁內(nèi)Cajal間質(zhì)細(xì)胞明顯減少，Cx43表達(dá)也明顯減低。張亞萍等用透射電鏡發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠ICC與其他細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)顯著破壞，線(xiàn)粒體腫脹，空泡樣變，細(xì)胞器數(shù)量減少，異染色質(zhì)明顯，肌膜分離形成空洞，ICC超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)斐善涔δ芨淖?，這可能是糖尿病胃腸功能紊亂的病因之一[14-16]。本研究通過(guò)多種分子病理學(xué)技術(shù)方法，采用免疫組化標(biāo)記c-kit和Cx43，透射電鏡觀(guān)察ICC的超微結(jié)構(gòu)等，比較半夏瀉心湯含藥血清治療前后糖尿病胃輕癱動(dòng)物模型胃平滑肌細(xì)胞、ICC和Cx43的變化，從而探討其治療作用及機(jī)制。這不僅能從細(xì)胞和分子水平探討半夏瀉心湯治療糠尿病胃輕癱的作用機(jī)制，也能為臨床防治胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病提供重要的理論依據(jù)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)采用免疫組化染色標(biāo)記c-Kit和Cx43抗體觀(guān)察實(shí)驗(yàn)豚鼠ICC和Cx43的數(shù)量和變化，以及采用透射電子顯微鏡觀(guān)察豚鼠ICC的超微結(jié)構(gòu)變化，從分子生物學(xué)角度基本闡明了半夏瀉心湯含藥血清治療糖尿病胃輕癱的作用機(jī)制，即半夏瀉心湯含藥血清能明顯增加大鼠ICC的數(shù)量并修復(fù)其受損結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)豚鼠的胃動(dòng)力并恢復(fù)其功能，從而起到治療糖尿病胃輕癱的作用，由此能成為中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)新的突破口。

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廣州市中醫(yī)藥中西醫(yī)結(jié)合科研課題資助(項(xiàng)目編號(hào)：2010A33號(hào))。

**作者簡(jiǎn)介：張燕(1978-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事臨床病理學(xué)而及相關(guān)科研研究，Tel：18022440260，E-mail：2817621@qq.com。

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