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      硝酸鉍修飾碳纖維電極循環(huán)伏安法測定水樣中的半胱氨酸

      2013-11-01 07:17:48朱永春
      關(guān)鍵詞:伏安半胱氨酸碳纖維

      李 飛,朱永春,田 紅,高 鷹

      (沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,沈陽 110034)

      0 引 言

      半胱氨酸(Cysteine)是一種含有巰基的氨基酸,在生命體中的酶催化、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)等方面起著關(guān)鍵性作用。在臨床上,與同型半胱氨酸一樣,半胱氨酸的濃度失調(diào)將導(dǎo)致心腦血管等疾病,被作為疾病的生物標(biāo)記物。半胱氨酸通常的分析方法包括分光光度法、紙層析法、生物測定法、電化學(xué)檢測法、氨基酸分析儀和高效液相色譜法等[1]。其中電化學(xué)檢測方法的簡單、快速、無毒、直接、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測等優(yōu)勢引起了廣泛的關(guān)注[2-5]。利用半胱氨酸分子中巰基—(SH)能夠與許多金屬有很強(qiáng)的相互作用的特點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)其在金屬電極上的固相微萃?。?-7],實(shí)現(xiàn)萃取和富集與分析一體化,提高電分析方法的靈敏度和選擇性[8-9]。鉍電極具有與汞電極相似的性質(zhì),常用于重金屬的分析測定,利用鉍與巰基的配位作用[10-11]。本文以碳纖維簇盤電極為基礎(chǔ)電極,電化學(xué)沉積鉍修飾電極,建立了半胱氨酸的固相微萃取和電化學(xué)檢測新方法。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 儀器設(shè)備與試劑

      儀器:CHI620b電化學(xué)分析儀(上海振華儀器公司),三電極體系(鉑絲為對極,飽和甘汞電極為參考電極,碳纖維簇電極為基礎(chǔ)工作電極。

      試劑:分別用磷酸氫二鈉,氫氧化鈉,檸檬酸作為緩沖溶液,控制pH范圍在3.0~10.6之間。硝酸鉀配成0.5mol/L濃度的溶液,做為支持電解質(zhì)溶液。硝酸鉍配成1.0mmol/L濃度的溶液,做為電極的修飾溶液。半胱氨酸配成0.001mol/L的儲備溶液,作為半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液,胱氨酸,白氨酸,牛血清白蛋分別配成0.001mol/L濃度的溶液,作為干擾實(shí)驗(yàn)的溶液。以上試劑均為分析純,均購買與沈陽國藥集團(tuán)。實(shí)驗(yàn)所用廢水取自沈陽師范大學(xué)校園的湖中,湖水煮沸十分鐘殺滅微生物,在室溫條件下用10000RPM離心機(jī)離心獲得。

      1.2 碳纖維電極的制備

      將一簇直徑約7μm的碳纖維以環(huán)氧樹脂固化在內(nèi)徑約3mm玻璃管中,置于空氣中放置晾干,一端在1 000目的金相砂紙和硫酸紙打磨拋光作為基礎(chǔ)工作電極。

      將基礎(chǔ)工作電極置于0.001mol/L的Bi(NO3)3溶液中,以循環(huán)伏安的法將鉍沉積到電極表面上,即獲得鉍修飾的碳纖微簇工作電極。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 半胱氨酸在鉍修飾電極上的電化學(xué)行為

      將鉍修飾電極分別置于含有1.0×10-7M半胱氨酸的pH=4.0的0.25M的硝酸鉀電解質(zhì)溶液中,在0.040V/s的掃速下進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn),獲得的循環(huán)伏安曲線如圖1所示。鉍修飾電極在電解質(zhì)溶液中,沒有氧化還原峰(曲線1),而在含有半胱氨酸的溶液中于0.414V處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰。屬于半胱氨酸與鉍形成絡(luò)合物的氧化峰。

      該峰隨掃速的關(guān)系呈非線性關(guān)系,回歸方程為

      此結(jié)果表明,電極過程受到擴(kuò)散和表面雙重控制,即與表面上沉積的鉍有關(guān),又與溶液中半胱氨酸向電極表面上擴(kuò)散有關(guān)。試驗(yàn)中選擇掃描速度為0.04V/s。

      圖1 鉍電極在含有(2)和不含有半胱氨酸的支持電解質(zhì)溶液中循環(huán)伏安曲線

      2.2 鉍沉積量的影響

      試驗(yàn)中以循環(huán)伏安法沉積鉍,在給定鉍鹽濃度、掃速和電位范圍下,鉍的沉積量與掃描圈數(shù)呈正比。保持其他條件不變,改變掃描圈數(shù),將獲得不同鉍沉積量的電極置于含有1.0×10-6mol/L半胱氨酸的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn),以獲得的氧化峰電流對掃描圈數(shù)作圖,如圖2所示。

      從圖2可知,當(dāng)掃描圈數(shù)為6圈時(shí),L-半胱氨酸的氧化峰值最大,所以確定硝酸鉍的最佳沉積圈數(shù)為6圈。

      圖2 氧化峰電流與循環(huán)伏安掃描圈數(shù)的關(guān)系

      2.3 溶液pH的影響

      半胱氨酸為三元弱酸,具有三級電離常數(shù),其pKa分別為2.12,8.21,10.38[]。溶液pH 決定半胱氨酸分子的存在形式,是與鉍原子相互作用的重要因素之一。通過磷酸緩沖體系控制溶液pH值在3.0~10.6范圍內(nèi),在含有濃度為10-6mol/L的半胱氨酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn),將獲得的氧化峰電流對溶液pH作圖,如圖3所示。

      隨溶液pH值的增加,氧化峰電流曲線變化,且分別在pH=4.0和pH=9.0處出現(xiàn)2個(gè)較大的峰,表明在此pH下,半胱氨酸的存在形式更有利于在鉍電極表面上吸附富集,使得氧化峰電流出現(xiàn)極大值??紤]到在弱堿條件下,鉍離子趨于形成氫氧化物沉淀而不利于半胱氨酸的吸附。因此,實(shí)驗(yàn)中選擇pH=4.0為最佳pH.

      2.4 最佳靜止時(shí)間

      靜止時(shí)間是指將鉍修飾電極置于半胱氨酸的溶液中進(jìn)行吸附富集,直到進(jìn)行循環(huán)伏安掃描之前的時(shí)間間隔。在保持其他條件不變下,改變不同的靜止時(shí)間進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn),將半胱氨酸溶液的氧化峰電流值對放置時(shí)間作圖,靜止時(shí)間為2s時(shí),峰電流最大,表明半胱氨酸與鉍電極表面作用較快,不需要等待時(shí)間即可完成吸附平衡。因此,實(shí)驗(yàn)上選擇2s為最佳靜止時(shí)間。

      2.5 最佳放置時(shí)間

      放置時(shí)間是指電極置于溶液中,施加初始電位所持續(xù)的時(shí)間。保持其他條件不變,在不同靜止時(shí)間下進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn),將L-半胱氨酸的氧化峰電流值對放置時(shí)間作圖,如圖4所示。

      半胱氨酸的氧化峰電流在放置時(shí)間為10s時(shí)最大,所以實(shí)驗(yàn)中選擇放置時(shí)間為10s。

      圖3 氧化峰電流與溶液pH關(guān)系

      2.6 半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

      在最佳條件下,對不同濃度的半胱氨酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn),將獲得的循環(huán)伏安曲線中半胱氨酸氧化峰電流對濃度的對數(shù)作圖,如圖5所示。

      半胱氨酸的氧化峰電流隨濃度的增大呈現(xiàn)兩段線性關(guān)系。在較低的半胱氨酸濃度范圍內(nèi)(1.0×10-16~1.0×10-10mol/L),氧化峰電流隨濃度的增加而增大,表明半胱氨酸-鉍絡(luò)合物濃度隨半胱氨酸濃度增加而增加,線性回歸方程為

      圖4 氧化峰電流與放置時(shí)間關(guān)系

      在半胱氨酸濃度范圍為1.0×10-7~1.0×10-4mol/L范圍內(nèi),氧化峰電流隨半胱氨酸濃度的增加而降低,表明半胱氨酸在鉍電極表面形成自組裝膜,而降低了半胱氨酸-鉍絡(luò)合物的氧化還原活性,導(dǎo)致電流下降。其回歸方程為

      在最佳條件下,進(jìn)行了10次檢測實(shí)驗(yàn)。平均氧化峰值電流為1.797 7±0.119 2μA,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%。

      圖5 峰電流與濃度的對數(shù)關(guān)系

      2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

      在相同優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,在含有1.0×10-13mol/L半胱氨酸溶液中加入等濃度的白氨酸、胱氨酸、蛋白質(zhì),進(jìn)行的干擾實(shí)驗(yàn)。改變比率,發(fā)現(xiàn)100倍的3種物質(zhì)均不影響半胱氨酸的檢測如表1所示。

      表1 不同摩爾比下的共存物質(zhì)下測定半胱氨酸的相對誤差 %

      2.8 實(shí)際水樣的檢測

      將沈陽師范大學(xué)校園湖水煮沸約10min,以殺死微生物,在室溫和10000RPM離心機(jī)離心。取湖水樣品溶液5.0mL,5.0mL緩沖液(pH 值4.0),5.0mL 0.5M 硝酸鉀。進(jìn)行了10次重復(fù)實(shí)驗(yàn),平均電流2.683μA,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得湖水中的半胱氨酸濃度估計(jì)為6.22μm。

      3 結(jié) 論

      綜上所述,循環(huán)伏安法研究了鉍修飾碳纖維簇電極上半胱氨酸的吸附萃取和電化學(xué)行為,并應(yīng)用于半胱氨酸的檢測,獲得以下結(jié)論:

      1)循環(huán)伏安法在碳纖維簇電極表面上沉積鉍粒子,實(shí)現(xiàn)了碳纖維電極的鉍修飾,為半胱氨酸的固相微萃取奠定基礎(chǔ);

      2)在最佳條件下,循環(huán)伏安法監(jiān)測了半胱氨酸的電化學(xué)行為及其固相微萃取的動力學(xué)和熱力學(xué)過程,建立了半胱氨酸的電化學(xué)檢測方法;

      3)半胱氨酸的固相微萃取電化學(xué)檢測具有較高的靈敏度和選擇性,共存的白氨酸,胱氨酸和蛋白質(zhì)不干擾檢測,用于污水中半胱氨酸的分析,結(jié)果令人滿意。

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