納米金催化光度法快速檢測葡萄糖

邱 小 香

(1.渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南714000;2.陜西省多河流濕地生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西渭南714000)

0 引言

葡萄糖在醫(yī)學(xué)上常被稱為血糖，俗名又稱玉米葡糖、玉蜀黍糖、右旋糖和葡糖等，分子式為C6H12O6，白色晶體，易溶于水.其結(jié)構(gòu)式中含5個羥基和一個醛基，具有多元醇和醛的性質(zhì)［1］.葡萄糖在工業(yè)、食品、藥品上都有很多應(yīng)用，所以對葡萄糖的定量分析有著很重要的意義.目前，用于檢測葡萄糖的方法主要有高效液相色譜法、滴定法、氣相色譜法、HPLC法［2］和生物傳感器法，其中液相色譜法雖然具有較好的靈敏度，但排除干擾能力差;滴定法雖然操作簡單，但是存在檢出限低、誤差大的問題;氣相色譜操作比較復(fù)雜;HPLC法和生物傳感器法的過程比較復(fù)雜，操作難度大.鑒于此，尋找一種快速、準(zhǔn)確、簡單的葡萄糖檢測方法有著重要的意義.實(shí)驗(yàn)采用納米金［3］催化葡萄糖與菲林試劑反應(yīng)生成磚紅色的氧化亞銅微粒，基于紫外—可見分光光度法建立了利用其吸光度值與葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系來測定葡萄糖含量的方法.實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、納米金的用量及菲林試劑(B)的用量等條件進(jìn)行了優(yōu)化.在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，葡萄糖濃度在0.05～1.00 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△A870nm=1.3674c葡萄糖+1.0848，相關(guān)系數(shù) R2=0.991.該方法具有成本低、操作簡單、靈敏度高等特點(diǎn)，并且用于注射劑中葡萄糖的檢測獲得了較好的結(jié)果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，UV－2000/2010紫外—可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

葡萄糖(C6H12O6，天津登豐化學(xué)品有限公司)，酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，硫酸銅(CuSO4·5H2O，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，抗壞血酸(C6H8O6，天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司)，碳酸鉀(K2CO3，天津市化學(xué)試劑廠)，氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，氫氧化鈉(NaOH，西安化學(xué)試劑廠)，葡萄糖注射液(上海華源安徽錦輝制藥有限公司).

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，所用的水都是二次蒸餾水.

1.2.2 納米金的制備

納米金的制備采用抗壞血酸還原法［5］.制備納米金所用的玻璃儀器在使用前用鉻酸洗液浸泡24 h，然后用二次水多次沖洗后烘干備用.取4℃冷卻的含1%氯金酸的溶液1.00 mL，現(xiàn)配的0.2 moL/L的碳酸鉀溶液1.50 mL及25 mL的水混合均勻，然后在其混合均勻后的溶液中邊攪拌邊加入含有0.7%的抗壞血酸溶液1.00 mL，溶液迅速變?yōu)樽霞t色，緩慢加熱至溶液顏色變?yōu)榱良t色.該納米金的濃度為0.765 μg/mL.

1.2.3 菲林試劑的制備

菲林試劑(A):稱取3.75 g的CuSO4·5H2O，加水溶解至100 mL(以硫酸銅計(jì)為0.15 moL/L);菲林試劑(B):稱取酒石酸鉀鈉17.0 g溶解于20 mL的熱水中，加入20%的氫氧化鈉溶液20 mL，加水至100 mL(以酒石酸鉀鈉計(jì)為0.81 moL/L，含氫氧化鈉6.1 moL/L).

1.3 實(shí)驗(yàn)原理及方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)基于葡萄糖的還原性，其與菲林試劑反應(yīng)，生成氧化亞銅磚紅色的沉淀.納米金對這一反應(yīng)有較強(qiáng)的催化作用［5－7］.氧化亞銅微粒在600～900 nm處有明顯的吸收，且隨著葡萄糖濃度的增加其吸光度值也隨之增大(見圖1c、d)，并在870 nm處呈良好的線性關(guān)系.根據(jù)葡萄糖濃度與吸光度值的線性關(guān)系及未知濃度葡萄糖溶液的吸光度值，計(jì)算出葡萄糖的濃度.

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL的比色管中，依次加入0.40 mL 0.15 moL/L菲林試劑(A)溶液，2.0 mL 0.81 moL/L菲林試劑(B)溶液，200 μL 0.765 μg/mL的納米金，混合均勻后加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至10 mL.在70℃水浴中反應(yīng)后流水快速冷卻至室溫，用分光光度計(jì)測得870 nm波長處的吸光度值，同時做空白試驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金對葡萄糖—銅(Ⅱ)微粒反應(yīng)的催化作用和吸收光譜

實(shí)驗(yàn)固定納米金的用量、菲林試劑(A、B)的用量、葡萄糖的濃度、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間，在600～900 nm的波長范圍內(nèi)，分別對菲林試劑—納米金、菲林試劑—葡萄糖、菲林試劑—納米金－4.46 mg/mL葡萄糖及菲林試劑—納米金－5.08 mg/mL葡萄糖體系進(jìn)行波譜掃描，結(jié)果如圖1所示.

從圖1可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，納米金對葡萄糖與菲林試劑的反應(yīng)具有較強(qiáng)的催化作用(圖1b、d)，葡萄糖和菲林試劑反應(yīng)生成的氧化亞銅微粒在可見光區(qū)600～900 nm之間均有吸收，且樣品與空白的吸光度值的差值在870 nm處較大，且具有良好的線性關(guān)系，故實(shí)驗(yàn)選取870 nm為測定波長.

圖1 吸收光譜

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 菲林試劑(B)用量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)固定納米金的用量、菲林試劑(A)的用量、葡萄糖的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，改變菲林試劑(B)的用量.在10 mL的比色管中先加入0.40 mL 0.15 moL/L的菲林試劑(A)，然后分別加入0.50 mL、0.80 mL、1.00 mL、2.50 mL、3.50 mL 0.81 moL/L 的菲林試劑(B)溶液，再加入 0.35 mL 0.765 ug/mL 的納米金，混勻后加入0.20 mL 10.11 mg/mL的C6H12O6，70℃水浴加熱4 min，流水冷卻后測其870 nm處的△A值.根據(jù)菲林試劑(B)的用量和吸光度值的關(guān)系作圖，結(jié)果如圖2所示.

圖2 菲林試劑(B)用量的影響

由圖2可以看出，在其他條件不變的情況下，當(dāng)菲林試劑(B)的用量在0.80 mL時△A的值最大.為了取得較大的吸光度值使實(shí)驗(yàn)具有更好的靈敏度及節(jié)約試劑，實(shí)驗(yàn)選用菲林試劑(B)的用量為0.80 mL.

2.2.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化

固定葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、納米金的加入量(0.35 mL)及反應(yīng)溫度(70℃);控制反應(yīng)時間分別為 1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，流水冷卻后測定870 nm處△A值.由吸光度值與時間作圖結(jié)果為圖3.

圖3 反應(yīng)時間的影響

由圖3可以看出，在其他條件不變時，反應(yīng)時間在1 min以內(nèi)，反應(yīng)幾乎不發(fā)生;在1～3.5 min內(nèi)吸光度值快速升高;3.5～4.5 min之間吸光度值有所下降;5 min以后吸光度值幾乎不變.為了獲得較大的吸光度值從而提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度，同時減少因操作導(dǎo)致的反應(yīng)時間上的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選擇5 min作為最佳實(shí)驗(yàn)條件.

2.2.3 納米金用量的優(yōu)化

控制葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、反應(yīng)時間(5 min)及反應(yīng)溫度(70℃)不變，分別加入納米金0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.50 mL，流水冷卻后測得870 nm處的△A值.作圖結(jié)果如圖4.

圖4 納米金用量的影響

由圖4可以看出，當(dāng)加入納米金的量在0.10～0.20 mL時吸光度值變化不大;納米金的用量在0.20～0.50 mL之間隨著納米金的用量的變化△A的值先增大后減小，且用量在0.35 mL時△A的值最大.故實(shí)驗(yàn)中納米金的用量應(yīng)選取0.35 mL.

2.2.4 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

按照實(shí)驗(yàn)方法，在固定葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、納米金的加入量(0.35 mL)，分別在50℃、60℃、70℃、80℃水浴中反應(yīng)3 min，測得吸光度值與溫度之間的線性關(guān)系如圖5所示.

圖5表明，在常溫下葡萄糖和菲林試劑幾乎不發(fā)生反應(yīng);而溫度從50℃ ～70℃變化時，吸光度值迅速增大，說明當(dāng)溫度在50℃ ～70℃之間時該反應(yīng)在納米金的催化作用下反應(yīng)速率快速增大;當(dāng)溫度大于70℃后，反應(yīng)速率雖然有所增加但增加的速度相對緩慢，說明此時納米金的催化作用降低，而導(dǎo)致反應(yīng)速率增大的原因主要是非催化作用，即溫度對反應(yīng)速率的影響.但溫度過高也加快了氧化亞銅微粒之間的碰撞，從而導(dǎo)致大量的氧化亞銅微粒發(fā)生聚集而快速沉淀，導(dǎo)致△A870nm迅速降低［8］.為了取得較大的△A870nm值，減少產(chǎn)物體系的穩(wěn)定性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)選擇70℃為最佳反應(yīng)溫度.

圖5 反應(yīng)溫度的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照實(shí)驗(yàn)方法，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，保持菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:0.80 mL)、納米金的用量200 μL，混勻后分別加入濃度為 10.11 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.90 mL，在最佳的反應(yīng)溫度(70℃)下，反應(yīng)5 min后流水冷卻至室溫，應(yīng)用上述建立的紫外—可見分光光度法測定其吸光度值.根據(jù)吸光度值和葡萄糖濃度的關(guān)系作圖，結(jié)果如圖6所示.由圖6可以看出，葡萄糖濃度在0.05～1 mg/mL范圍內(nèi)與△A值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△A870nm=1.3674C葡萄糖+1.0848，相關(guān)系數(shù) R2=0.991.

圖6 葡萄糖的濃度和吸光度值的線性圖

2.4 樣品測定

準(zhǔn)確移取1.00 mL葡萄糖注射液，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度.在10 mL的比色管中加入菲林試劑(A)0.40 mL，菲林試劑(B)0.80 mL，納米金200 uL，混勻后加入上述溶液1.00 mL，70℃水浴反應(yīng)5 min，流水冷卻后測其吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出溶液濃度.

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

每組準(zhǔn)確加入葡萄糖注射液的稀釋溶液1.00 mL，分別加入濃度為10.11 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.23 mL、0.41 mL、0.51 mL.在70℃水浴下反應(yīng)5 min，流水冷卻后測得吸光度值.計(jì)算回收率結(jié)果如表 1所示.結(jié)果表明，回收率為102.64% ～107.57%，說明該方法的準(zhǔn)確度高.

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)結(jié)合納米金對葡萄糖還原銅(Ⅱ)的反應(yīng)具有較強(qiáng)催化作用、氧化亞銅微粒在870 nm處的特定吸收，建立了納米金催化光度法測定葡萄糖的新方法.與其他方法比較，該方法所用試劑廉價、操作簡單，用于葡萄糖注射液的測定，結(jié)果滿意.

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