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    亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠脂代謝的影響及其抗氧化作用

    2013-11-01 03:17:42唐慧勤衛(wèi)智權(quán)
    中成藥 2013年5期
    關(guān)鍵詞:全血高脂血癥黃酮

    唐慧勤,馮 旭,閻 莉,衛(wèi)智權(quán)

    (廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西南寧 530001)

    亮葉楊桐系山茶科楊桐屬植物亮葉楊桐Adinandra nitida Merr.ex Li的干燥葉[1],主要生長在陰冷潮濕的懸崖峭壁或溝谷溪澗邊,在我國的黔、桂、云、川等省均有分布,尤以平樂縣產(chǎn)量最多[2-3]。該植物具有消炎解毒、降壓、退熱和止血等作用,民間用于防治各種炎癥、無名腫毒及外傷等[4]。而現(xiàn)代研究表明,它還有抗腫瘤、抑制癌基因、抗氧化和抑菌等功效[5-7]。其主要成分黃酮類的量為20%左右,是目前發(fā)現(xiàn)在自然植物中含黃酮類量最高的植物之一[8-9]。本研究通過建立高脂血癥大鼠模型,觀察亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠的脂質(zhì)代謝的影響和抗氧化作用。

    1 材料

    1.1 藥物 亮葉楊桐購自廣西平樂縣供銷社,廣西中醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為山茶科楊桐屬植物亮葉楊桐Adinandra nitida Merr.ex Li的干燥葉。血脂康膠囊:北大維信生物科技有限公司,批號20050507。

    1.2 動物 健康SD大鼠,體質(zhì)量約200~220 g,雄性,由廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究所提供[SPF級動物,動物許可證號:SCXK桂2003-0001]。

    1.3 試劑 膽固醇,上海伯奧生物有限公司,批號 050705;膽鹽,杭州微生物試劑有限公司,批號:20 050516;總膽固醇(TC)試劑盒,德國奧林巴斯(Olympus)公司,批號2575;甘油三酯(TG)試劑盒德國奧林巴斯(Olympus)公司,批號3112;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒,德國奧林巴斯(Olympus)公司,批號3659;谷草轉(zhuǎn)氨酶AST試劑盒,德國奧林巴斯(Olympus)公司,批號1937;谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒,德國奧林巴斯(Olympus)公司,批號2751;低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒,中北北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品,批號 242021;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,南京建成生物工程研究所,批號20 051013;丙二醛(MDA)試劑盒,南京建成生物工程研究所,批號20 051006;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,中國藥品生物制品檢驗(yàn),批號0080-9303。

    1.4 儀器 TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、L600臺式低速自動平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、AU400全自動生化分析儀(德國Olympus)、LG-R-80B型血液黏度儀和血小板聚集凝血因子分析儀(北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)。

    2 方法

    2.1 藥物樣品制備[5]取1000 g亮葉楊桐,粉碎過20目篩,用8倍70%乙醇在70℃下浸提4 h,共3次,合并提取液并過濾,回收溶劑,水相用石油醚脫酯,再用乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯萃取液,減壓回收溶劑,得黃綠色粉末,即亮葉楊桐總黃酮樣品。

    2.2 亮葉楊桐總黃酮的測定 準(zhǔn)確稱取于120℃干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對照品15.20 mg,用甲醇溶解并稀釋至刻度。準(zhǔn)確量取此液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL量瓶中,分別加5%NaNO20.1 mL,放置6 min,加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL,放置6 min。再加10%NaOH 10 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,混勻,放置15 min。在510 nm處測定溶液吸光度(A),得出總黃酮質(zhì)量濃度(C)吸光度(A)回歸方程:A=11.289C-0.09511,相關(guān)系數(shù)R=0.9997。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知在0.02403~0.07296 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將亮葉楊桐總黃酮樣品稀釋一定質(zhì)量濃度,精密吸取1.0 mL于25 mL量瓶中,同上法處理后測定溶液吸光度,將吸光度值代入回歸方程計算得總黃酮的質(zhì)量濃度,并計算亮葉楊桐總黃酮樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.3%。

    2.3 模型制備[10]取 SD大鼠 60只,體質(zhì)量200~220 g,雄性,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組,每組10只,即正常組、模型組、血脂康對照組、亮葉楊桐總黃酮高、中、低劑量組。除正常組每日給予普通飼料喂養(yǎng),其余各組每日給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料87%、膽固醇2%、膽鹽1%、豬油10%),連續(xù)喂養(yǎng)5周。5周后,大鼠禁食不禁水10 h,隨機(jī)抽取每組5只大鼠,共30只,斷尾取血,測TC、TG,確定造模是否成功。

    2.4 給藥 造模成功后,于次日給藥。正常組和模型組給藥等量蒸餾水,血脂康對照組劑量為300 mg/kg,亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組分別為200、400、600 mg/kg,各組均按1 mL/100 g體質(zhì)量ig給藥,每日1次,連續(xù)35 d。每3天稱定質(zhì)量1次,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。用藥期間正常組飼以普通飼料,模型組和各給藥組每只大鼠仍給與高脂飼料以維持模型,自由飲水。

    2.5 標(biāo)本采集 治療35 d后,禁食(不禁水)12 h,末次給藥1 h后,10%烏拉坦1 mL/100 g腹腔注射麻醉,取腹主動脈血6 mL,其中3 mL血待自然凝固后,3000 r/min,離心10 min,分離血清,用于測定血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、ALT、AST。另外1 mL用肝素鈉40 U/mL抗凝用于測定全血黏度,2 mL用枸櫞酸鈉抗凝用于血小板聚集的測定。同一位置取肝組織用異丙醇提取,測定肝臟TC、TG。

    2.6 血清、肝臟脂質(zhì)和生化指標(biāo)的測定 取血清在全自動生化分析儀上按試劑盒要求測定TC(酶法)、TG(酶法)、HDL-C(酶法)、LDL-C(清除法)、MDA(TBA法)、SOD(黃嘌呤氧化法)、ALT(IFCC法)、AST(IFCC法)。

    2.7 全血黏度的測定 取1 mL血液,按40 U/mL肝素抗凝,加到血液流變儀測定全血低切、中切、高切黏度。

    2.8 比濁法測定血小板聚集性 取血2 mL,500 r/min離心10 min,制備富血小板血漿(PRP);再以3000 r/min離心10 min,制備貧血小板血漿(PPP)。調(diào)節(jié)PRP中血小板密度約在200×109L-1,以終濃度5μmol/L的ADP為血小板聚集誘導(dǎo)劑,采用比濁法于37℃測定血小板最大聚集率。

    2.9 統(tǒng)計方法 用SPSS11.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計,組間比較用單因素方差分析,結(jié)果以表示。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響 模型組血清TC、TG及LDL-C均明顯升高,HDL-C明顯降低(與正常組比,P<0.05),說明高脂血癥大鼠模型成功。用亮葉楊桐總黃酮治療后,低、中、高劑量組血清TC、TG、LDL-C水平均明顯降低(P<0.05),HDL-C水平明顯升高。血脂康組亦可降低血清TC、TG及LDL-C(P<0.05),但對HDL-C無影響。結(jié)果見表1。

    表1 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響(,n=10)Tab.1 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(,n=10)

    表1 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清中脂質(zhì)水平的影響(,n=10)Tab.1 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(,n=10)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。表2~4同。

    LDL-C/(mmol·L-1)正常組 - 0.74±0.09 1.39±0.24 1.09±0.20 0.33±0.06模型組 - 1.39±0.45* 3.48±0.78* 0.81±0.12* 1.35±0.32*血脂康組 300 1.05±0.08△ 2.10±0.21△ 0.81±0.12 0.75±0.08△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 1.01±0.14△ 2.96±0.98 0.95±0.13△ 1.13±0.28亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 0.98±0.22△ 2.76±0.54△ 0.94±0.15△ 1.11±0.27亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 0.85±0.19△ 2.59±0.61△ 0.81±0.08 0.98±0.27組 別 劑量/(mg·kg-1)TC/(mmol·L -1)TG/(mmol·L -1)HDL-C/(mmol·L -1)△

    3.2 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響 模型組大鼠與正常對照組比較,血清中 SOD顯著下降(P<0.05),MDA顯著上升(P<0.05),提示模型組大鼠抗氧化能力下降,脂質(zhì)過氧化物生成增多;而AST、ALT明顯升高(P<0.05),表明肝功能受到損傷。亮葉楊桐總黃酮低劑量可顯著升高血清中SOD水平(P<0.05),各劑量組均可顯著降低血清中MDA水平(P<0.05)。而血脂康組SOD和MDA與模型組比無統(tǒng)計意義。結(jié)果顯示,亮葉楊桐總黃酮的抗氧化能力較強(qiáng)。此外,亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組均可降低其肝臟 TC、TG和血清AST、ALT水平(P<0.05)。血脂康組亦可減低肝臟TC、TG及血清AST、ALT水平(P<0.05),亮葉楊桐總黃酮作用與其相似。結(jié)果見表2。

    表2 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響(,n=10)Tab.2 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum SOD,MDA,AST and ALT in hyperlipidemic rats(,n=10)

    表2 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠血清SOD、MDA、AST和ALT的影響(,n=10)Tab.2 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on serum SOD,MDA,AST and ALT in hyperlipidemic rats(,n=10)

    ALT/(U·L -1)正常組 - 425.46±14.69 4.01±0.76 255.71±43.60 65.15±12.68模型組 - 404.60±16.16* 6.80±2.56* 332.69±43.46* 109.77±13.62*血脂康組 300 426.26±47.94 5.13±1.86 260.59±35.79△ 70.03±8.41△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 440.21±18.58△ 4.76±1.90△ 315.99±32.69 81.52±9.10△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 411.16±34.32 3.86±1.03△ 265.05±62.71△ 82.02±15.39△亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 397.35±22.04 4.24±0.79△ 235.14±54.14△ 71.40±5.09組 別 劑量/(mg·kg -1)SOD/(U·L -1)MDA/(mmol·L -1)AST/(U·L -1)△

    3.3 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響 模型組大鼠肝臟中TC、TG明顯升高,與正常對照組比較有顯著意義(P<0.05),提示大鼠肝臟可能發(fā)生了脂肪變性。亮葉楊桐總黃酮低、中、高劑量組可降低其肝臟TC、TG(P<0.05)。血脂康組亦可減低肝臟 TC、TG(P<0.05),亮葉楊桐總黃酮作用與其相似甚至稍強(qiáng)。結(jié)果見表3。

    3.4 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響 模型組大鼠與正常對照組比較,血小板聚集率增加(P<0.05),低、中切全血黏度顯著上升(P<0.05),高切全血黏度無顯著意義,提示高脂血癥大鼠血流變學(xué)發(fā)生了變化。亮葉楊桐總黃酮低、高劑量能顯著抑制血小板聚集率(P<0.05);亮葉楊桐總黃酮中、高劑量能降低大鼠低切全血黏度(P<0.05),高劑量降低中切全血黏度(P<0.05),但對高切全血黏度均無影響。血脂康僅降低血小板聚集率(P<0.05),對全血黏度均無影響。結(jié)果見表4。

    表3 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響(,n=10)Tab.3 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on liver TC,TG in hyperlipidemic rats(,n=10)

    表3 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠肝臟中TC、TG的影響(,n=10)Tab.3 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on liver TC,TG in hyperlipidemic rats(,n=10)

    TG/(mmol·L -1)正常組 - 1.49±0.70 2.80±0.73模型組 - 5.87±0.92* 6.94±1.06*血脂康組 300 4.28±0.72△ 5.78±0.12△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 4.07±0.66△ 4.92±1.11△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 4.90±0.48△ 5.76±0.81△亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 5.40±0.72 5.37±1.45組 別 劑量/(mg·kg-1)TC/(mmol·L -1)△

    表4 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響(,n=10)Tab.4 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on blood viscosity and platelet maximum aggregation rate in hyperlipidemic rats(,n=10)

    表4 亮葉楊桐總黃酮對高脂血癥大鼠全血黏度和血小板聚集率的影響(,n=10)Tab.4 Effect of total flavonoids from Adinandra nitida on blood viscosity and platelet maximum aggregation rate in hyperlipidemic rats(,n=10)

    組 別 劑量/(mg·kg-1)全血黏度低切/(mPa·s) 中切/(mPa·s) 高切/(mPa·s) 血小板聚集率/%正常組 - 4.60±0.59 3.04±0.18 2.71±0.19 48.07±8.27模型組 - 5.80±0.41* 3.25±0.16* 2.73±0.13 60.41±5.87*血脂康組 300 5.60±0.76 3.17±0.21 2.75±0.13 53.32±5.23△亮葉楊桐總黃酮低劑量組 200 5.75±0.64 3.32±0.19 2.92±0.19 47.02±6.47△亮葉楊桐總黃酮中劑量組 400 5.26±0.42△ 3.14±0.19 2.76±0.10 54.95±8.03亮葉楊桐總黃酮高劑量組 600 4.79±0.53△ 3.06±0.25△ 2.74±0.24 51.87±6.47△

    4 討論

    動脈粥樣硬化是缺血性腦血管病的主要病理基礎(chǔ),而脂質(zhì)代謝異常是動脈粥樣硬化形成的重要因素[11-13]。現(xiàn)已知血清TC、TG和 LDL-C水平與動脈粥樣硬化呈正相關(guān),HDL-C水平與動脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)。高脂血癥可引起血液流變學(xué)的異常,導(dǎo)致全血黏度增加,紅細(xì)胞變形能力下降,造成微循環(huán)障礙。在動脈粥樣硬化形成的過程中伴有脂質(zhì)過氧化損傷,血液和組織細(xì)胞中MDA水平增多,也使血小板膜損傷并聚集變形釋放出氧自由基,造成對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷和平滑肌細(xì)胞增殖。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明亮葉楊桐總黃酮可顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C水平,提高HDLC水平,說明其可通過直接清除血清中脂質(zhì),增加脂質(zhì)的逆轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂代謝的作用;抑制TC、TG在肝臟中的聚集,減少血清中AST、ALT水平,發(fā)揮抗脂肪肝和保護(hù)肝功能的作用;顯著提高血清中SOD活性,抑制MDA產(chǎn)生,提高機(jī)體的抗氧化能力;對二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用;直接降低全血黏度,尤其是低切血液黏度,同時它也可以間接通過降低血清TC、TG,升高HDL-C,增加紅細(xì)胞膜流動性,改善高脂血癥大鼠血液流變學(xué)而起到調(diào)節(jié)脂質(zhì)作用,抗動脈粥樣硬化作用。

    亮葉楊桐富含生物活性成分,具有較高營養(yǎng)保健和藥用價值,開發(fā)應(yīng)用的潛力很大。本研究為亮葉楊桐進(jìn)一步開發(fā)打下基礎(chǔ),有較高的參考價值。

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