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    利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低溫條件下獲得酶-底物復(fù)合物實(shí)際結(jié)構(gòu)的方法

    2013-10-31 10:31:20王薇劉一葦李宏濱
    生物工程學(xué)報(bào) 2013年12期
    關(guān)鍵詞:電子密度糖苷酶復(fù)合物

    王薇,劉一葦,李宏濱

    中國科學(xué)院微生物研究所,北京 100101

    準(zhǔn)確地把握生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是了解生命過程的基礎(chǔ),對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的解析,可給出大量的其本身及所屬體系的信息。該工作可大致分成以下4個(gè)環(huán)節(jié):高純度大分子樣品的制備;晶體的獲得;結(jié)構(gòu)的解析;結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)下的生物學(xué)研究。在目前的技術(shù)條件下,樣品晶體的質(zhì)量是影響其結(jié)構(gòu)解析的主要原因[1-3]。影響生物大分子晶體及其復(fù)合物質(zhì)量的主要原因是分子的化學(xué)穩(wěn)定性及構(gòu)象一致性較差而得不到穩(wěn)定的復(fù)合物晶體。例如,在通常條件下,當(dāng)酶與底物發(fā)生反應(yīng)時(shí),底物會(huì)被酶降解,所以不易清楚地看到底物和酶的結(jié)合情況。突變酶中關(guān)鍵基團(tuán)使酶失活以及選用底物類似物替代原有底物的的方法,經(jīng)常被用來捕捉酶和底物的結(jié)合,但由此方法獲得的結(jié)構(gòu)多為近似結(jié)構(gòu)。另外,在常溫條件下酶與底物的結(jié)合一般不太穩(wěn)定,這樣底物即便在失活酶中的位置也經(jīng)常不易確定。

    我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)[4-7]:在低溫 (?20 )℃條件下,分子構(gòu)象的一致性、分子間結(jié)合的穩(wěn)定性都會(huì)大大改善,一般酶的生物活性也會(huì)大幅度降低。由此獲得的酶-底物復(fù)合物更為穩(wěn)定,得到的晶體結(jié)構(gòu)衍射數(shù)據(jù)更趨于復(fù)合物結(jié)合時(shí)的實(shí)際結(jié)構(gòu)[8-9]。More等的研究也發(fā)現(xiàn)[10],當(dāng)溫度由70 ℃降到?20 ℃時(shí),β-葡萄糖苷酶的活性由100%降到 0.01%,也就是說在?20 ℃條件下,該酶基本失活?;谏鲜隹紤],我們提出了“酶晶體低溫抑活底物固定”方法。該方法是在低溫環(huán)境下浸泡底物,此時(shí)酶基本失去活性,底物不易降解,而酶和底物結(jié)合的穩(wěn)定性卻大大提高,平衡后迅速進(jìn)行液氮固定,首先,可以獲得真實(shí)的酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu);其次,可進(jìn)一步提高底物的占有率和空間穩(wěn)定性,提高底物電子密度的質(zhì)量。

    為了進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn)[11],我們選擇了 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA)。根據(jù)催化底物分解時(shí)是否需要輔因子,BglA分兩類:糖基水解酶家族1 (Glycoside hydrolase family 1,GH1)和糖基水解酶家族4 (Glycoside hydrolase family 4,GH4)。GH4的 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在催化底物分解時(shí)需要金屬離子 (Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+)和NAD+的輔助,同時(shí)需要一個(gè)還原性環(huán)境[12-15],而GH1的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則可以獨(dú)立完成催化作用[16-17],其大小約50 kDa。BglA于1972年首次從產(chǎn)氣桿菌 Aerobacter aerogenes中被分離得到[18],隨后1974年在大腸桿菌Escherichia coli中又再次被純化出來[19]。BglA能專一性地水解6-磷酸-β-葡萄糖苷鍵,可將底物對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P)水解為對(duì)硝基苯酚和 6-磷酸-β-葡萄糖[20-21]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    bglA基因 (EC31211186)由上海捷瑞生物工程有限公司合成;宿主桿菌主菌株 E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3)和載體 pET-28a由本室保存;SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;His-TrapTMHP 5 mL購自于美國 GE公司;蛋白晶體篩選試劑 Crystal Screen HR2-110和 HR2-112購自美國 Hampton Research公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自美國 Pierce公司;底物 pNPβG6P 由美國 National Institutes of Health (NIH)的Dr. John Thompson提供。

    1.2 BglA的表達(dá)

    將構(gòu)建好的 pET-28a-bglA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3),轉(zhuǎn)化成功的單克隆菌株置于20 mL LB 培養(yǎng)基中 (卡那霉素 5 μg/mL),過夜培養(yǎng)后接種于2 L LB搖瓶,37 ℃振蕩培養(yǎng),當(dāng)OD600達(dá)到 0.6~0.8時(shí),加入 IPTG至終濃度0.001 mol/L,37 ℃繼續(xù)振搖5 h,6 000 r/min離心10 min收集細(xì)菌。

    1.3 BglA的提取與純化

    收集的細(xì)菌用80 mL PBS (pH 7.4)重懸后,超聲波破碎裂菌,12 000 r/min離心10 min,收集上清。利用蠕動(dòng)泵將上清液與His-Trap HP鎳柱過夜結(jié)合。采用快速蛋白液相色譜法,以緩沖液 A (20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,pH 8.0)和緩沖液 B (20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑,pH 8.0)對(duì)結(jié)合有蛋白的鎳柱進(jìn)行梯度洗脫,并進(jìn)行蛋白峰收集及SDS-PAGE檢測(cè)。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,pH 8.0),經(jīng) Superdex 200凝膠層析柱進(jìn)一步純化,蛋白峰收集并再次進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。

    1.4 蛋白晶體的生長

    蛋白晶體的培養(yǎng)采用懸滴式蒸氣擴(kuò)散法,篩選試劑來源于 Crystal Screen HR2-110和HR2-112試劑盒。將1 μL蛋白溶液與1 μL池液混勻,同200 μL的池液進(jìn)行氣相平衡,靜置于16 ℃環(huán)境生長。

    1.5 常溫試驗(yàn)

    首先,準(zhǔn)備晶體板,并制備防凍液。防凍液成分:1 μL 50% (V/V)甘油,2 μL 池液 (0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium),pH 7.5,10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇4 000 (Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。用尼龍環(huán)挑取BglA蛋白晶體,放入防凍液中,加入3 μL 20 mmol/L底物 pNPβG6P。用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物,放入液氮固定。

    1.6 低溫試驗(yàn)

    準(zhǔn)備低溫晶體板,用水將含有甘油的紙條潤濕,再將坐滴孔內(nèi)加滿水,蓋上玻璃蓋,以保持環(huán)境的濕度;制備防凍液,成分為:1 μL 50%(V/V)甘油,2 μL 池液(0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium),pH 7.5,10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇 4 000(Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。之后用尼龍環(huán)挑取出BglA蛋白晶體,放入防凍液中,迅速置于?20 ℃低溫冰箱中。靜置 10 min后,迅速取出蛋白晶體板,快速加入3 μL 20 mmol/L底物pNPβG6P。再次將晶體板放回?20 ℃低溫冰箱中。靜置10 min后迅速取出晶體板,用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物,放入液氮固定。

    2 結(jié)果

    2.1 BglA的表達(dá)與純化結(jié)果

    為了有效地純化蛋白,在設(shè)計(jì) bglA重組序列時(shí),在C末端多加了1段由6個(gè)組氨酸構(gòu)成的His-tag。攜帶重組質(zhì)粒 pET-28a-bglA的 E. coli BL21在37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)大量可溶性BglA蛋白,分子量大小約50 kDa。

    利用組氨酸標(biāo)簽和咪唑的相互作用,通過His-Trap層析柱梯度洗脫,在40 mmol/L咪唑濃度及 60 mmol/L濃度附近獲得濃度較高的蛋白(圖 1)。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液,經(jīng)Superdex 200凝膠層析柱,BglA進(jìn)一步被純化 (圖 2),隨后用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,蛋白濃度高達(dá)8 mg/mL。

    圖1 BglA鎳柱親和層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a His-Trap HP column. M: protein marker. The collected fractions of BglA corresponding to the SDS-PAGE lanes 1,2,3.

    圖2 BglA凝膠過濾層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a Superdex 200 10/300 column. M: protein marker. The collected fraction of BglA corresponding to the SDS-PAGE lane 1.

    2.2 晶體生長結(jié)果

    晶體的生長條件篩選選用Hampton Research的Crystal Screen的HR2-110和HR2-112試劑盒,共98個(gè)不同條件的池液,每個(gè)池液含有緩沖液,沉淀劑和鹽3類成分。觀察發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)不同的條件均生長出了晶體,其中在池液成分為0.1 mol/L HEPES sodium (pH 7.5)、10% (V/V)2-propanol、20% (W/V)PEG 4 000的生長條件下,經(jīng)過2周的時(shí)間,生長出了能夠達(dá)到X射線衍射條件的晶體 (圖 3)。

    2.3 數(shù)據(jù)收集、處理結(jié)果及底物電子密度圖

    圖3 在某一條件下得到的蛋白晶體Fig. 3 Crystals of BglA. The crystals of BglA grown at 16 ℃, and the longest dimension of the crystals is 290 μm.

    表1 BglA晶體衍射數(shù)據(jù)Table 1 Data collection and refinement statistics

    在?20 ℃的低溫條件下,利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法,將BglA晶體與底物進(jìn)行浸泡,并用液氮固定,通過X射線進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)收集并處理,獲得了完整的底物電子密度圖。BglA晶體衍射數(shù)據(jù)的空間群屬于P212121,最高分辨率為2 ?,結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。數(shù)據(jù)收集和優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)前,我們選用前期生長良好的BglA晶體,使用常規(guī)方法,進(jìn)行了酶與底物浸泡的對(duì)比試驗(yàn)。所用晶體的空間群屬于I222,晶胞參數(shù)為a=69.441 ?,b=86.902 ?,c=161.765 ?,最高分辨率為 2.4 ?,結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。經(jīng)優(yōu)化處理后得到了水解底物的電子密度圖。通過對(duì)比的衍射電子密度圖顯示,底物pNPβG6P在經(jīng)低溫處理的BglA晶體結(jié)構(gòu)中有完整的電子密度;對(duì)于未經(jīng)低溫處理的BglA晶體,底物在相應(yīng)位置已經(jīng)被水解(圖 4)。

    3 討論

    3.1 低溫防凍劑配方的選擇

    在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)時(shí),選用甘油作為主防凍劑,但當(dāng)用尼龍環(huán)挑出單顆晶體放入防凍劑之后,晶體出現(xiàn)了迅速融化的現(xiàn)象。之后,我們對(duì)此環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn),嘗試放入多顆晶體,以使溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。在放入第1顆晶體時(shí),晶體依然很快融化;繼續(xù)放入第2顆,晶體只是部分開裂;放入第3顆晶體后,該晶體完好。另外,我們也嘗試將晶體加入不含甘油的池液,晶體并未開裂或融化,但經(jīng)過?20 ℃低溫處理后,再次觀察發(fā)現(xiàn)晶體部分開裂,用尼龍環(huán)挑晶體時(shí)出現(xiàn)了斷裂現(xiàn)象,說明此時(shí)的晶體脆性增強(qiáng),防凍劑的保護(hù)不可或缺。因此,找到適合各種溫度的多體系低溫防凍劑配方,使晶體不易開裂并可以承受更深的低溫是我們需要進(jìn)一步解決的問題。

    3.2 “酶晶體低溫抑活底物固定”方法對(duì)底物電子密度的影響

    圖4 不同條件下獲得的底物電子密度圖Fig. 4 Comparison between the electron density of bound substrates from two methods. 2Fo-Fc electron density map is contoured at 1.0 σ, the left shows that the substrate was hyzrolyzed at normal temperature, the right shows that the electron-density of the substrate was intact at ?20 ℃.

    本研究使用的“酶晶體低溫抑活底物固定”方法,是在?20 ℃條件下將 BglA晶體與pNPβG6P進(jìn)行浸泡,通過X射線收集衍射數(shù)據(jù)并處理,最終獲得了完整的底物電子密度圖。與常規(guī)方法相比較,使用的底物相同,但取得的效果卻差別明顯。我們認(rèn)為,用常規(guī)方法無法獲得完整的底物電子密度,因?yàn)橐话忝冈诔R?guī)溫度下都能夠迅速水解底物,而“酶晶體低溫抑活底物固定”方法是在保持天然結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下,將酶活力降低到幾乎失活的水平,延緩底物的水解。另外在低溫狀態(tài)下,pNPβG6P的 β糖苷鍵的柔性會(huì)降低,使得硝基苯基團(tuán)的位置更固定,也有利于取得較好的電子密度。

    3.3 低溫酶學(xué)及復(fù)合物中間態(tài)的進(jìn)一步研究

    為了進(jìn)一步試驗(yàn)“酶晶體低溫抑活底物固定”方法在低溫酶學(xué)研究領(lǐng)域的普適性,在獲得了BglA與其底物復(fù)合物的實(shí)際結(jié)構(gòu)后,我們還利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的酰亞胺酶 (Imidase)與其特異性底物進(jìn)行了浸泡試驗(yàn),獲得了比較完整的底物電子密度圖。由于復(fù)合物晶體的衍射數(shù)據(jù)低于3 ?,我們正在進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化篩選,以期獲得優(yōu)于3 ?的數(shù)據(jù)結(jié)果,進(jìn)而得到理想的底物電子密度圖。另外,我們也正在選擇其他的酶與底物進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn),進(jìn)一步擴(kuò)大復(fù)合物中間態(tài)的研究范圍。

    3.4 低溫條件下的單晶生長

    從“酶晶體低溫抑活底物固定法”自然派生出的一個(gè)思路便是研究深低溫條件下生物大分子單晶生長的技術(shù)。如前所述,在深低溫條件下生物大分子有著更好的化學(xué)穩(wěn)定性和構(gòu)象一致性,有望得到分辨率更高的晶體。目前,我們已經(jīng)利用溶菌酶在?20 ℃低溫環(huán)境下進(jìn)行晶體生長實(shí)驗(yàn),以不同濃度 DMSO替代甘油作為主防凍劑進(jìn)行梯度試驗(yàn),獲得了生長良好的晶體,并得到了較高分辨率的衍射數(shù)據(jù)。

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