慈菇中抗真菌蛋白分離純化初步研究

朱立成，羅 輝，曾 鉑，殷帥文

慈菇中抗真菌蛋白分離純化初步研究

*朱立成1，羅 輝2，曾 鉑1，殷帥文1

（1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009）

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了一套天然的防御系統(tǒng)。其中植物抗真菌蛋白（antifungal protein，AFP）是主要成員之一，它對(duì)多種植物和人體病原真菌生長(zhǎng)有抑制作用。本研究以慈菇（）塊莖為材料，運(yùn)用陽(yáng)離子交換層析和葡聚糖G50凝膠過(guò)濾層析技術(shù)，結(jié)合活性追蹤法，對(duì)慈菇中的抗真菌蛋白進(jìn)行了初步分離純化。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表明，純化的抗真菌蛋白并不是單一的組分，至少有3個(gè)電泳條帶，分子量集中在14.4~20.1 kD之間。純化的抗真菌蛋白對(duì)煙草赤星病菌（）的菌絲生長(zhǎng)具有較明顯抑制作用。

慈菇； 抗真菌蛋白；抗真菌活性

0 前言

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中隨時(shí)會(huì)受到各種病原菌的侵染，所以在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，其自身形成了一套天然的防御系統(tǒng)，產(chǎn)生一些物質(zhì)來(lái)與外源病菌對(duì)抗。植物抗真菌蛋白就是其中的一類(lèi)，它們可抑制真菌生長(zhǎng)或殺死真菌[1]。根據(jù)植物抗真菌蛋白血清學(xué)和蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果，可將植物抗真菌蛋白大致分為七大類(lèi)，包括病程相關(guān)蛋白、防御素、類(lèi)親環(huán)素蛋白、核糖體失活蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白酶抑制劑、2s清蛋白類(lèi)等。植物抗真菌蛋白種類(lèi)較多，其抗真菌機(jī)制也各有不同，如富含半胱氨酸的防御素(Defensins)能引起真菌細(xì)胞通透性的改變，導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡；幾丁質(zhì)連接蛋白(chitin-binding proteins)通過(guò)干擾細(xì)胞壁的極化從而使得細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制[2]等。所以，尋找新的植物抗真菌蛋白，或者發(fā)現(xiàn)新的植物抗真菌蛋白的抗真菌機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)抗真菌的新藥具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

慈菇（）為澤瀉科多年生草本植物，以富含淀粉的球莖供食用。原產(chǎn)中國(guó)，歐洲作為觀賞植物栽培，中國(guó)、日本、印度和朝鮮作蔬菜用。中國(guó)主要產(chǎn)區(qū)分布于長(zhǎng)江流域及其以南各省，太湖沿岸及珠江三角洲栽培尤多，北方栽培較少[3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慈菇性微寒，味甘苦，無(wú)毒。入心、肝、肺三經(jīng)，能清熱利尿，行血通淋，化痰止咳。目前關(guān)于慈菇抗真菌蛋白方面的研究報(bào)道較少，本文對(duì)慈菇塊莖中的抗真菌蛋白進(jìn)行初步的分離純化鑒定，并就其抗真菌活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

慈菇購(gòu)于上海市楊浦區(qū)某菜市場(chǎng)。陽(yáng)離子交換層析劑CM-Sephadex、葡聚糖G50購(gòu)自 GE Healthcare；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購(gòu)于上海西巴斯生物技術(shù)有限公司；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。

1.1.2 菌種

煙草赤星病菌（）菌種由井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 PDA培養(yǎng)基

稱(chēng)取馬鈴薯200 g，切碎加蒸餾水煮后，取濾液加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入千分之一的100 mg/mL氨芐青霉素，混勻后倒平板備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗真菌蛋白抽提

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g慈菇，加入100 mL pH 5.7的磷酸鹽緩沖液后磨碎，4℃抽提2 hr。抽提液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，12000 rpm離心20 min，取上清備用。

1.2.2 陽(yáng)離子交換層析

用pH 5.7的磷酸鹽緩沖液平衡陽(yáng)離子柱5-10個(gè)體積后，再將慈菇抽提上清液上柱。打開(kāi)色譜工作站，280 nm檢測(cè)。上樣結(jié)束后分別用含0、0.1、0.3、0.5和1 mol/L NaCl的洗脫。收集洗脫峰濃縮后進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。

1.2.3 凝膠過(guò)濾層析

有抑菌活性峰凍干粉中加入2~3 mL pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液，12000 rpm離心10 min ，上樣到預(yù)先用pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液平衡的葡聚糖G-50層析柱中，pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液洗脫后收集各洗脫峰，各峰濃縮后進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法[4]。將煙草赤星病菌菌種分別接種于PDA固體培養(yǎng)基平板中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~20 h，待菌落直徑達(dá)5 cm左右，在距離菌落邊沿約0.5 cm處貼上無(wú)菌φ6.25 mm濾紙片，并加10 μL樣品于濾紙片上，將平板置于28℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h左右后，觀察有無(wú)抑菌作用。

1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[5]

有抑菌活性的凝膠過(guò)濾層析洗脫峰用SDS-PAGE電源鑒定，其分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳2 hr左右后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色、脫色后比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)離子交換層析

利用陽(yáng)離子交換柱對(duì)慈菇抽提液進(jìn)行純化，280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，用含不同濃度NaCl的pH5.7的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等共5個(gè)洗脫峰，如圖1所示。將各峰收集濃縮后測(cè)活，發(fā)現(xiàn)有抑菌活性的成分主要集中在Ⅲ和Ⅳ洗脫峰。

圖1 慈菇抽提液陽(yáng)離子交換層析色譜圖

2.2 葡聚糖G-50凝膠過(guò)濾層析

將陽(yáng)離子交換層析有抑菌活性峰Ⅲ、Ⅳ經(jīng)凍干后溶解于pH5.7的磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)過(guò)葡聚糖G-50層析柱凝膠過(guò)濾層析純化后，活性峰Ⅲ分離出3個(gè)不同的洗脫峰（如圖2所示），活性峰Ⅳ分離出4個(gè)不同的洗脫峰（如圖3所示）。

圖2 活性峰Ⅲ葡聚糖G50凝膠過(guò)濾層析圖

圖3 活性峰Ⅳ葡聚糖G-50凝膠過(guò)濾層析圖

2.3 各層析峰抑菌活性檢測(cè)

采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)陽(yáng)離子交換層析各洗脫峰進(jìn)行測(cè)活，發(fā)現(xiàn)洗脫峰Ⅲ，Ⅳ具有較好的抗真菌活性，結(jié)果圖4所示。

從圖4可以看出，慈菇蛋白粗提液經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換層析后，具有抑菌活性的AFPs主要存于洗脫峰Ⅲ和洗脫峰Ⅳ中，洗脫峰Ⅰ中也有少量的抗真菌物質(zhì)，這些抗真菌物質(zhì)對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制活性。

1. 磷酸鹽緩沖液2. 洗脫液Ⅰ 3. 洗脫液Ⅲ 4. 洗脫液Ⅳ

1. Ⅲ①； 2. Ⅲ②；3. Ⅲ③； 4.磷酸鹽緩沖液

活性峰Ⅲ經(jīng)過(guò)G50凝膠過(guò)濾層析后，三個(gè)洗脫峰都有不同的抑菌效果，其中Ⅲ①活性峰抑菌效果稍差，而Ⅲ②、Ⅲ③活性峰抑菌效果較好?；钚苑澧艚?jīng)過(guò)G50凝膠過(guò)濾層析純化后，洗脫峰Ⅳ①、Ⅳ②、Ⅳ③抑菌效果較為明顯，而洗脫峰Ⅳ④無(wú)明顯抑菌效果。

2.4 SDS-PAGE電泳

將陽(yáng)離子交換層析有抗菌活性峰Ⅲ和Ⅳ進(jìn)行葡聚糖G50凝膠過(guò)濾層析后，收集各洗脫峰中的蛋白溶液經(jīng)凍干濃縮至1~2 mL，取20 μL蛋白溶液加入5 μl 5×loading緩沖液混勻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，我們分離的抗真菌蛋白并不是單一的組分，至少有3個(gè)電泳條帶，分子量集中在14.4~20.1 kD之間。

1. Ⅳ①； 2. Ⅳ②；3. Ⅳ③； 4. Ⅳ④

1. Ⅳ③；2. Ⅳ②；3. Ⅳ①；4. Ⅲ③；5. Ⅲ②；6. Ⅲ①；M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量

3 討論

作物真菌病害是植物病害中最為嚴(yán)重的一類(lèi)，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。尋找具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì)，克隆其基因，利用基因工程的方法導(dǎo)入植物中培育出抗病品種，或者轉(zhuǎn)入大腸桿菌或酵母里表達(dá)生產(chǎn)微生物農(nóng)藥是植物病害防治的重要方向之一，一些多肽抗生素已經(jīng)用于植物抗病基因工程。隨著對(duì)植物抗真菌蛋白作用機(jī)制的深入研究，越來(lái)越多的抗真菌蛋白基因?qū)⒈昏b定和克隆，通過(guò)一些更有效的改良基因工程策略的建立，植物抗真菌蛋白將在植物真菌病害的綜合防治中發(fā)揮更大的作用[2]。

植物抗菌蛋白通常為堿性蛋白。本研究利用陽(yáng)離子交換層析和葡聚糖凝膠過(guò)濾層析等蛋白質(zhì)分離純化手段，結(jié)合活性追蹤法，從慈菇中初步分離純化出具有抑制煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抗真菌蛋白。雖然SDS-PAGE鑒定最終純化的抗真菌蛋白并不是單一蛋白組分，但是可以初步判斷慈菇中的抗真菌蛋白分子量大約為14.4kD左右。因?yàn)樵诖裙街泻胸S富的由179個(gè)氨基酸殘基組成的慈菇蛋白酶抑制劑，分子量約為20 kD左右[6]，圖7中20kD附近的蛋白質(zhì)條帶可能是慈菇蛋白酶抑制劑。但是，我們從預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，純化的天然慈菇蛋白酶抑制劑并沒(méi)有抑制煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的活性（實(shí)驗(yàn)結(jié)果未在本文顯示）。所以慈菇中抗真菌蛋白應(yīng)該是圖7中14.4kD附近的兩個(gè)蛋白質(zhì)。關(guān)于慈菇塊莖中抗真菌蛋白的進(jìn)一步純化、其它理化性質(zhì)和作用機(jī)制有待于今后深入研究。

[1] 朱立成.中國(guó)紫藤種子抗真菌肽的研究[D].上海:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,2010.

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PRELIMINARY STUDY ON ISOLATION AND PURIFICATION OF ANTIFUNGAL PROTEIN FROM

*ZHU Li-cheng1, LUO Hui2, ZENG Bo1, YIN Shuai-wen1

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China )

Plant antifungal proteins, the key component of innate immune system in plant, show a great potential in inhibiting or killing various human and plant pathogenic fungi. In this study, we tracked the bioactivity of antifungal proteins, used a series of methods such as cation exchange chromatography and sephadex G50 chromatography to isolate the antifungal proteins from. The results show that the purified antifungal proteins fromare not a single component, at least three protein bands those molecular weight range from 14.4~20.1 kD were detected by SDS-PAGE. The experiments of antifungal activity show that the purified antifungal proteins apparently inhibit the growth ofhypha

; antifungal protein (AFP); antifungal activity

Q939.11/S154.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.007

1674-8085(2013)04-0033-04

2013-04-01；

2013-06-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260076);江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GZN0125)

*朱立成(1972-），男，江西吉水人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)研究(E-mail：zjist@yahoo.com.cn)；

羅 輝(1971-），男，江西吉水人，副教授，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究(E-mail：jgsmcxb@163.com);

曾 鉑(1985-），男，江西泰和人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail：smkx05by@126.com);

殷帥文(1978-），男，湖南瀏陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)(E-mail：shwyin@126.com).