亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌碳青霉烯酶基因檢測(cè)

崔蘭英，常 東，路 娟，王 穎，羅文濤

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

陰溝腸桿菌是當(dāng)前多家醫(yī)院引起醫(yī)院感染的重要病原菌，該菌引起的感染范圍廣泛，耐藥性也在不斷發(fā)生變化。近年來(lái)由于碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌逐年增加，使臨床抗感染治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本文旨在研究哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌碳青霉烯酶的主要基因型及其流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年5月至2012年10月期間臨床分離出的亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌24株。菌種鑒定及藥物敏感試驗(yàn)經(jīng)Vitek-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(bioMerieux，F(xiàn)rance)完成。對(duì)每一菌株藥物敏感試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)檢。

1.1.2 試劑 所用抗菌藥物紙片包括慶大霉素(CN)、妥布霉素(TM)、阿米卡星(AK)、復(fù)方新諾明(SXT)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、氨曲南(ATM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)，均購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗(yàn) 判斷折點(diǎn)按照2010年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。入選標(biāo)準(zhǔn)為亞胺培南中介或耐藥，即MIC=2 μg/mL(中介)或≥4 μg/mL(耐藥)，K-B法折點(diǎn)為20～22 mm(中介)或≤19 mm(耐藥)

1.2.2 基因擴(kuò)增和測(cè)序 采用PCR方法對(duì)入選菌株碳青霉烯酶基因進(jìn)行檢測(cè)。采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，引物序列根據(jù)GenBank中提供的序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為引物各 2 μL，模板 DNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 混合物4 mL，Taq 1 U，總體積50 μL。擴(kuò)增條件為94℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)30次，最后72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果直接登陸 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株來(lái)源

24株陰溝腸桿菌來(lái)源于血液16株(66.7%)，痰 5 株(20.8%)，尿液 1 株(4.2%)，創(chuàng)面分泌物1株(4.2%)，引流液1株(4.2%);其中，ICU病房13株(54.2%)，呼吸內(nèi)科5株(20.8%)，腎內(nèi)科2株(8.3%)，神經(jīng)外科2株(8.3%)，骨外科1株(4.2%)，泌尿外科1株(4.2%)。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。待測(cè)的24株陰溝腸桿菌均表現(xiàn)為多重耐藥，對(duì)亞胺培南及美羅培南中介或耐藥，對(duì)所有青霉素類、頭孢菌素類抗生素耐藥，對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥率分別為70.8%、79.2%、75.0%、83.3%、87.5%、91.7%。

2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析

本次試驗(yàn)共檢測(cè)4種我國(guó)常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因(KPC-2、IMP-1、IMP-2、VIM)，共有 20 株菌擴(kuò)增出KPC-2條帶，經(jīng)測(cè)序后與GenBank序列對(duì)比，證實(shí)均為 KPC-2型碳青霉烯酶基因(DQ989640.1)。另4株菌未檢測(cè)到待測(cè)基因。

表2 24株陰溝腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The antimicrobial susceptibility test result of 24 Enterobacter cloacae

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物一直以來(lái)是治療多重耐藥腸桿菌，尤其是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和Amp C酶菌株的一線藥物。陰溝腸桿菌是引起醫(yī)院感染的常見(jiàn)條件致病菌，耐藥性和基因型不斷發(fā)生變化［1］，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床中的廣泛使用，耐碳青霉烯的陰溝腸桿菌逐年增加，給臨床治療帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。

本試驗(yàn)菌株標(biāo)本來(lái)源以血液和痰為主，科室多見(jiàn)于ICU和呼吸內(nèi)科。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)24株菌皆表現(xiàn)為多重耐藥(一種微生物對(duì)3類或3類以上抗生素同時(shí)耐藥)，部分菌株對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)一定的敏感性［2］，建議臨床，尤其高發(fā)科室根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果聯(lián)合用藥治療亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌感染。

基因擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果表明哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶以KPC-2型為主，與余蘭等［3］的報(bào)道有一定差異，可能與地域有關(guān)。范建中等［4］認(rèn)為我國(guó)華東地區(qū)碳青霉烯酶主要為KPC-2型。近年來(lái)，KPC酶在世界范圍內(nèi)快速播散，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌等都有發(fā)現(xiàn)該酶的報(bào)道。細(xì)菌產(chǎn)生耐碳青霉烯類抗生素的機(jī)制非常復(fù)雜，產(chǎn)碳青霉烯酶是細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因［5-6］。另外，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和Amp C酶同時(shí)外膜蛋白缺失，外排泵超表達(dá)等都可引起細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥［7］，本次試驗(yàn)中有4株菌株未檢測(cè)到待檢測(cè)的4種碳青霉烯酶基因(KPC-2、IMP-1、IMP-2、VIM)，可能由這些因素引起，也可能是產(chǎn)生其他碳青霉烯酶基因(如SME、GES等)導(dǎo)致。一些因素可促進(jìn)碳青霉烯酶的產(chǎn)生，如長(zhǎng)期應(yīng)用頭孢菌素類抗生素或碳青霉烯類抗生素，Livermore等［8］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用喹諾酮類抗生素也可誘導(dǎo)碳青霉烯酶的產(chǎn)生。

由于亞胺培南不敏感的陰溝腸桿菌多為多重耐藥菌株，可選擇的抗生素非常受限，患者感染難于控制，死亡率高。臨床應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，合理應(yīng)用抗生素，同時(shí)注意消毒隔離，避免該耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。

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