一株高產(chǎn)木聚糖酶真菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析

孫 婕，郁惠蕾，李春秀，寇振福，許建和

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

從生物質(zhì)中提煉可持續(xù)利用的生物能源，已經(jīng)漸漸成為各國應(yīng)對能源危機的主要策略之一。生物質(zhì)大量存在于自然界中，主要從農(nóng)作物殘余物的木質(zhì)纖維素中獲得，由于其來源廣泛且成分復(fù)雜，因此，完全降解木質(zhì)纖維素存在一定的難度。

木質(zhì)纖維素的主要組分包括纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等三大類。纖維素是一種以β－1，4－糖苷鍵聚合而成的葡萄糖聚合物，而半纖維素則是位居第二的組分，與纖維素之間以非化學(xué)鍵結(jié)合，所占比例范圍為15% ～35%［1］，高效降解半纖維素便可以暴露更多的纖維素酶作用位點，提高木質(zhì)纖維素的降解效果。半纖維素的完全降解則需要多種酶類的協(xié)同作用，主要包括主鏈的β－1，4－木糖苷鍵裂解酶和側(cè)鏈的取代基團裂解酶(如阿拉伯糖呋喃糖苷酶等)，其中主鏈酶包括木聚糖內(nèi)切酶(endo－1，4 －β －xylanase，EC 3.2.1.8)和木糖苷酶(β －D－xylosidase，EC 3.2.1.37)。自然界存在的半纖維素酶往往以多酶復(fù)合物形式存在，主要來源于細菌、真菌、放線菌等［2］。已報道的酶活較高的菌株主要集中在木霉屬(Trichoderma sp.)和曲霉屬(Aspergillus sp.)中。本研究主要是利用一種快速篩選的手段從自然界中篩選高產(chǎn)半纖維素酶的新菌株，并對其產(chǎn)酶性能進行初步研究。

傳統(tǒng)的菌株篩選工作需要耗費大量的時間和精力，具有周期長、重復(fù)性差等缺點，因此建立一種高通量篩選方法是加快篩選進程的關(guān)鍵因素。纖維素酶高通量篩選的方法已被多個課題組報道［3－5］，而將此平臺應(yīng)用于半纖維素酶中尚未見報道。在初步分離的候選菌株復(fù)篩過程中，筆者利用96孔板系統(tǒng)進行菌株培養(yǎng)、酶液分離以及酶活測定的快速篩選過程，同時考察天然半纖維素底物的處理以及濃度對產(chǎn)木聚糖酶的影響和效果，以期為今后進一步的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與底物處理

所用土樣采自全國各地，使用距離地面至少10 cm的土樣，以環(huán)境多樣性為標(biāo)準。收集到的土樣用無菌水梯度稀釋后，進行平板篩選和液體篩選。

篩選底物玉米芯粉、稻草以及小麥稈先被粉碎成顆粒，經(jīng)過0.15 mm分樣篩得到所需大小的粉末，再分別將10 g粉末置于500 mL三角瓶中，加入4%NaOH 300 mL，121℃加熱蒸煮20 min，冷卻后用紗布過濾除去固體，濾液4℃保存過夜，5 mol/L HCl中和至中性，4℃靜置過夜;發(fā)現(xiàn)會有沉淀生成，8000 r/min離心15 min，去上清，沉淀再用95%乙醇洗滌3次，最后的泥狀沉淀經(jīng)干燥碾磨后，作為微生物篩選的半纖維素底物。

1.2 菌株初篩

初篩培養(yǎng)基(g/L):半纖維素粉10.0，酵母膏4.5，NH4NO33.0，NaCl 5.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，瓊脂 15.0;pH 7.0(液體培養(yǎng)基成分相同，不加瓊脂)。將土樣稀釋后涂布到初篩培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)2～3 d后，挑取單菌落進行液體純培養(yǎng)，再接種到新的培養(yǎng)平板上，測定半纖維素酶活性透明圈的大小［6］。

1.3 菌株復(fù)篩

將泥狀半纖維素沉淀均勻平鋪在培養(yǎng)皿上(3～5 mm厚度)，靜置1～2 h，65℃干燥過夜。得到的均一底物薄片，用打孔器切成圓片狀，作為96孔深孔板酶發(fā)酵的底物。每個孔中加入1 mL初篩培養(yǎng)基(不含玉米芯粉)和1片上述預(yù)制的底物薄片，置于30℃、500 r/min的振蕩器(HTC Biotech Co.)上培養(yǎng) 2 d，4000 r/min 離心 5 min，測定上清液酶活，測定體系為(96孔深孔板)100 μL木聚糖溶液(1 mg/mL birchwood xylan，Sigma公司)、180 μL 50 mmol/L pH 5.0 醋酸鈉緩沖液、20 μL 酶液。50℃水浴保溫1 h后，加入120 μL 3，5－二硝基水楊酸(DNS)，煮沸5 min，待冷卻后加入160 μL去離子水，混勻后移取200 μL到酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測定550 nm下吸光值。

1.4 木聚糖酶活力的測定

在試管中分別加入1 mL木聚糖溶液(1 mg/mL)和1.8 mL pH 5.0醋酸鈉緩沖液，再加入0.2 mL稀釋5倍的粗酶液，50℃反應(yīng)15 min，加入2 mL DNS，煮沸10 min，定容至10 mL。用分光光度計測定550 nm波長的吸光度(OD550)，測定時以緩沖液作為空白對照。定義每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol木糖的酶量為1個活力單位(U)。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米芯粉10.0，KH2PO43.0，蛋白胨 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaNO32.0，CaCl2·2H2O 0.1，Mandels 1%(V/V，pH 5.0)。其中 Mandels溶液成分為 MnSO40.16%，ZnSO40.14% ，F(xiàn)eSO40.5% ，CoCl20.2%［7］。發(fā)酵優(yōu)化在裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進行，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)時間、pH、C源種類和C源濃度進行考察。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液在10000 r/min離心20 min，取上清液測定胞外酶的活力。

1.6 菌種鑒定

在1.5 mL離心管中加入100 μL無菌水，刮取3～4環(huán)新鮮培養(yǎng)的菌絲體于離心管中。振蕩均勻后，8000 r/min離心2 min，棄上清液。在1.5 mL離心管中加入150 μL裂解液(江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心提供)，振蕩均勻后，85℃反應(yīng)25 min得到基因組DNA粗提液。利用ITS序列通用引物(上游:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';下游:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增、純化及測序。最后將測序結(jié)果進行BLAST比對。

1.7 酶的純化及初步表征

收集發(fā)酵上清液，冰浴中進行(NH4)2SO4分級沉淀，每加入20%飽和度的細磨(NH4)2SO4粉末后，靜置0.5 h，8000 r/min離心10 min。沉淀的各個分級蛋白用50 mmol/L、pH 6.0醋酸銨緩沖液溶解，透析過夜，并測定木聚糖酶活力。選用40% ～60%蛋白組分進行超濾，4℃、8000 r/min離心30 min，取濃縮后的酶液4℃、10000 r/min離心10 min，取上清液500 μL進行Superdex G－75凝膠過濾。采用AKTA Explorer層析系統(tǒng)，50 mmol/L pH 6.0醋酸銨緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，自動收集每管500 μL組分，分別測定酶活，SDS－PAGE法測定相對分子質(zhì)量?？疾靝H對酶活力的影響:將酶液置換到不同pH緩沖液(pH 3.0～6.0檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.5～8.0磷酸鹽緩沖液，pH 8.0～10.0巴比妥鈉鹽酸緩沖液)中，室溫放置5 h，冰浴0.5 h，測定殘余木聚糖酶活力?？疾旆磻?yīng)溫度對酶活力的影響:分別在不同溫度下，測定木聚糖酶活力來確定最適溫度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選及鑒定

2.1.1 菌株初級篩選結(jié)果

從自然界中篩選木聚糖酶已有報道［8－10］。筆者采用3種不同的農(nóng)作物秸稈作為篩選底物，同時對底物進行預(yù)處理，去除纖維素等其他成分，得到其中的半纖維素成分，以篩選能產(chǎn)半纖維素酶的菌株。上百份采集到的土樣，經(jīng)固體培養(yǎng)基分離、液體純培養(yǎng)后，測定活性透明圈大小，結(jié)果見圖1。

根據(jù)底物和土樣的不同，共有11個批次，D值表示透明圈的直徑，d值表示菌落直徑，D/d較大表示菌株的產(chǎn)酶能力較強。由圖1可知:共有564個單菌落表現(xiàn)出了半纖維素降解酶活性，其中362株菌株的透明圈D/d在0～5之間，123株菌株的透明圈D/d在5～8之間，透明圈D/d大于8的共有79株。值得注意的是，大多數(shù)帶有菌絲的菌株的D/d都大于8。同時發(fā)現(xiàn)以水溶性較好的小麥稈作為底物時，較容易篩選得到較高酶活的菌株。進一步對篩選得到的D/d大于5的202株菌株進行了木聚糖酶活力的復(fù)篩。

圖1 利用透明圈法初篩產(chǎn)酶菌株的數(shù)據(jù)統(tǒng)計Fig.1 Primary screening of microbial strains through halo-forming method

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

對202株菌株的木聚糖酶活力進行了復(fù)篩，建立了一個基于96孔深孔板的菌株培養(yǎng)、酶液分離以及酶活測定的平臺，并考察了該方法的操作可行性與數(shù)據(jù)可靠性。首先，半纖維素泥狀沉淀被加工成均一圓片狀，避免了大量不可溶底物的繁瑣稱量過程。其次，將部分菌株的初篩D/d與孔板測得的木聚糖酶活力比較，發(fā)現(xiàn)兩者趨勢基本一致(圖2(a))。將排名前13的菌株酶活與購買的4株保藏菌株(上海工業(yè)微生物所)進行了比較(圖2(b))。購買的菌株分別為黃孢平革原毛菌(Phanerochaete chrysosporium)、黑曲霉(Aspergillus niger)、綠色木霉(Trichoderma viride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)，發(fā)現(xiàn)其中黑曲霉的木聚糖酶活力在購買的菌株中是最高的。而篩選得到的 PAM111、UV4、PDA23、H29、RS14、RS88、RS91、RS97、WS40、WS191、M1、ECU2023、WDF8 的酶活都相對較高，其中ECU2023的酶活最高，約是A.niger酶活力的1.3倍，菌株H29、M1和RS88也都顯示出了較高的木聚糖酶活力。具有較高活力的菌株均產(chǎn)生明顯的菌絲體或孢子。

2.1.3 菌株鑒定結(jié)果

對篩選到的ECU2023菌株進行鑒定，利用絲狀真菌(及酵母)的核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribed spacer，ITS)的 方 法，對ECU2023序列進行BLAST比對，鑒定為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

2.2 ECU2023菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時間的影響

圖2 復(fù)篩菌株的木聚糖酶活力比較Fig.2 Xylanase activity assay in second-round screening of strains

圖3為發(fā)酵培養(yǎng)時間對木聚糖酶活力的影響。由圖3可知:培養(yǎng)至第4天時木聚糖酶活力達到最高，酶活從大到小依次為 A.awamori ECU2023、RS88、A.niger、M1、H29，這與 96 孔板篩選的酶活結(jié)果是一致的。接種24 h后，觀察到有少量菌絲或孢子形成，但是木聚糖酶活力較低。培養(yǎng)時間超過48 h后，有大量菌絲或孢子產(chǎn)生，而且木聚糖酶活力迅速增加，在第4天時達到最高值。菌體培養(yǎng)時間超過4 d后，酶的活力都有所降低。

圖3 培養(yǎng)時間對木聚糖酶活力的影響Fig.3 Effects of culture time on xylanase activity

2.2.2 pH 的影響

通過初篩、復(fù)篩以最后確定酶活最高的ECU2023為選定菌株，對其培養(yǎng)基pH進行考察，發(fā)現(xiàn)ECU2023的pH適應(yīng)范圍較廣，在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)酶活差異不超過7%，在pH 6.0時酶活達到最高。這與文獻［11］報道的木聚糖酶活力最佳pH相符合。

2.2.3 C 源的影響

共考察了13種C源(20 g/L)，包括一些單糖(葡萄糖、木糖等)、模式底物(微晶纖維素(αcellulose)、羧甲基纖維素鈉(CMC)等)和天然底物(玉米芯、稻草、小麥稈粉等)，產(chǎn)酶結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出:當(dāng)以天然底物為C源時，木聚糖酶活力要明顯高于其他底物，其中以玉米芯粉和小麥稈粉的效果最好，酶活分別可達到36.7和28.9 U/mL。主要原因可能是天然底物雖然沒有經(jīng)過預(yù)處理，但是富含木聚糖，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生木聚糖酶，與之前報道的麩皮、稻草和甘蔗等的誘導(dǎo)效果相對應(yīng)［12－15］。進一步采用玉米芯粉和小麥稈粉作為底物，考察C源濃度對產(chǎn)木聚糖酶的影響。

圖4 培養(yǎng)基C源優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization of carbon sources in fermentation culture

2.2.4 C源質(zhì)量濃度的影響

C源濃度的考察結(jié)果見圖5。由圖5可知:ECU2023利用不同基質(zhì)時，其底物耐受度也有差別，但都有一個最適濃度，玉米芯粉為40 g/L，小麥稈粉為50 g/L。天然底物濃度過低或過高都會影響分泌木聚糖酶，以小麥稈粉作為底物時，低于40 g/L或者高于50 g/L都會大大降低木聚糖酶活力。而以玉米芯粉作為底物時，在10～70 g/L都能穩(wěn)定地分泌出木聚糖酶。底物濃度過低時不利于誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶，濃度過高時會形成較厚的懸浮層，而不能充分混勻從而影響傳質(zhì)。發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期底物的固體顆粒沉在搖瓶底部，當(dāng)培養(yǎng)一段時間后，菌體已經(jīng)將固體顆粒包裹或消化，發(fā)酵液底部無顆粒沉淀，混濁消失，菌體呈現(xiàn)球狀，這可能跟霉菌利用半纖維素的方式有關(guān)。從經(jīng)濟效益考慮，以天然物質(zhì)為底物，也可大大降低成本，采用30～40 g/L的玉米芯粉最為合適。

圖5 培養(yǎng)基C源的質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of carbon source concentration in fermentation of xylanase

2.3 木聚糖酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)的初步表征

經(jīng)40% ～60%(NH4)2SO4分級沉淀后，上樣至Superdex G－75進行凝膠過濾，圖6(a)為層析洗脫曲線，酶活峰出現(xiàn)在20管左右，比酶活達到 36.6 U/mg，純化倍數(shù)為 27.7 倍，收率為0.93%，操作過程中損失較多。SDS－PAGE結(jié)果見圖6(b)，發(fā)現(xiàn)較明顯蛋白條帶的相對分子質(zhì)量為 2.2 × 104。

圖6 木聚糖酶Superdex G-75凝膠過濾洗脫曲線和SDS-PAGE電泳圖Fig.6 Gel filtration on Superdex G-75 column of xylanase xylanase activity and SDS-PAGE of purified xylanase

粗純化后的木聚糖酶最適pH和最適溫度分別為6.0和50℃(圖7)，同時，pH為5.0～8.0，溫度為30～50℃，木聚糖酶活力都相對穩(wěn)定。

圖7 pH和溫度對木聚糖酶活力的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on xylanase activity

3 結(jié)論

初步篩選到能產(chǎn)透明圈的564株微生物菌株，利用基于96孔深孔板的篩選方法對其中202株菌株進行了快速復(fù)篩，共得到13株高產(chǎn)木聚糖酶的菌株，其中以編號ECU2023的酶活最高，鑒定為泡盛曲霉。對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，確定培養(yǎng)條件:pH為6.0，培養(yǎng)時間為4 d，最佳C源為玉米芯粉，C源濃度為30～40 g/L。

對初篩菌株透明圈活性與96孔深孔板測得的木聚糖酶活力進行比較，發(fā)現(xiàn)酶活力的變化趨勢是基本一致的，較高酶活的菌株用兩種方法測定的活力都是相對較高的，可以認為這個快速篩選平臺是可信的。同時，DNS法測還原糖往往需要多個步驟，對于大量試樣的處理會耗費很多時間，利用96孔深孔板可大大提高該方法的效率。將來也可將此平臺應(yīng)用于篩選其他酶類。在考察C源時，發(fā)現(xiàn)C源的選擇以及C源的濃度都會影響木聚糖酶的分泌。而大多數(shù)木聚糖酶都被分泌到胞外。因此，采用了天然農(nóng)作物秸稈作為底物，其中玉米芯粉富含半纖維素，發(fā)現(xiàn)使用玉米芯粉時酶的活力比用單糖作C源時增加很多?；|(zhì)濃度越低或越高并非有相同的效果，底物濃度越高可能會產(chǎn)生大量有毒性的中間產(chǎn)物，阻遏酶的合成，然而，底物濃度過低又不足以誘導(dǎo)木聚糖酶的產(chǎn)生。

初步純化得到的木聚糖酶活力在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)都相對穩(wěn)定，具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價值，相信通過進一步的分子改造，可用于造紙、食品、能源等工業(yè)。利用本文報道的篩選平臺發(fā)掘更多新的木聚糖酶，有利于促進木聚糖酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，尤其是可以通過提高與纖維素酶的協(xié)同作用來解決非常迫切的能源與環(huán)境等可持續(xù)發(fā)展問題。

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