海濱錦葵塊根皂苷及多糖的分離、純化及對細胞增殖活性的影響

李思宇，袁亞光，欽 佩，張鶴云，張?zhí)?/p>

南京大學鹽生植物實驗室，南京210093

海濱錦葵(Kosteletzkya virginica)是錦葵科海濱錦葵屬多年生宿根和耐鹽油料植物，分布于美國含鹽沼澤地帶，1993年由南京大學生命科學學院鹽生植物實驗室引種進入國內［1］。皂苷(saponin)是一類皂苷元與糖結合處的糖苷，在植物界分布廣泛，是最常見的中藥有效成分之一［2］，很早就被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤細胞生長的特性［2-6］。根據(jù)皂苷苷元部分的不同，把皂苷分為甾體皂苷和三萜皂苷兩大類［2］，海濱錦葵塊根內的皂苷經(jīng)鑒定，屬于三萜皂苷。植物多糖(polysaccharides)是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的線性或分支的聚合物［7］，在生命活動中，多糖參與機體自身免疫防御系統(tǒng)［8］。除了比利時魯汶大學的學者對海濱錦葵體內的多糖粘液做了定位與成分分析，探討了多糖粘液在海濱錦葵抗鹽生理中的作用以外［9］，國內外尚未見將上述兩種活性成分從海濱錦葵塊根中同步分離的報道［10，11］，本實驗對海濱錦葵塊根中的皂苷及多糖進行了分離、提純，并對皂苷的體外抑制腫瘤細胞增殖特性、多糖的免疫活性進行了初步研究，旨在推動海濱錦葵塊根活性成分的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

海濱錦葵塊根，采自江蘇大豐金海農場種植基地;昆明種小白鼠，雌雄各半，體重17～22 g，由南京醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心提供，清潔級;肝癌HepS細胞株由中科院上海藥物研究所提供，本實驗室培養(yǎng)傳代;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，南京大治生物科技有限公司提供;ConA，F(xiàn)luKa公司產品;胎牛血清，北京元亨圣馬生物技術研究所提供;其他常用試劑均為分析純。

DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司;CO2培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司;TG162W型微量高速離心機，長沙湘儀離心機儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海濱錦葵塊根皂苷及多糖的提取

取海濱錦葵塊根洗凈、干燥、粉碎，取50 g，以1:15(w:v)的比例加蒸餾水，用超聲儀超聲提取，超聲條件:溫度60℃，功率200 w，時間1 h，超聲后用紗布過濾，濾液存放，濾渣再用上述條件重復一次。兩次濾液合并，減壓蒸發(fā)，得濃縮液。加70%的酒精沉淀多糖，用真空泵抽濾多次，得到粗多糖和濾液。濾液旋轉蒸發(fā)得到少量皂苷粗提液。

將皂苷粗提液上D101大孔樹脂，先用蒸餾水洗去雜質，然后用40%乙醇洗滌其他物質，最后使用80%乙醇洗脫，得到含有錦葵皂苷的乙醇洗脫液，將此溶液旋轉蒸發(fā)去乙醇，得到精制的含錦葵塊根皂苷的濃縮液。

將錦葵粗多糖加入適量水溶解后，加入等體積20%三氯乙酸，沉淀去除蛋白，離心得上清液，減壓蒸餾后的濃縮液對水透析，透析后的溶液加乙醇沉淀，干燥，得去蛋白塊根多糖溶液。將該溶液上DEAE-纖維素柱層析，用0～1 mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分部收集，測定各管以得洗脫峰，合并洗脫峰濃縮，干燥得初步純化的多糖。

1.2.2 皂苷的酸水解獲取皂苷元

取上述提取的部分皂苷，吹干，溶于20 mL，4%的硫酸溶液中，加入20 mL的石油醚，在80℃水浴酸解4 h。完畢后傾入分液漏斗中，冷卻、分層，取上層(石油醚溶液)，先用碳酸鈉溶液洗至中性，再用蒸餾水洗滌，回收石油醚，蒸干，置60℃下真空干燥，得到提取物皂苷元，稱重即可。

1.2.3 MTT法細胞體外增殖分析

1.2.3.1 海濱錦葵塊根皂苷、皂苷元對肝癌細胞(HepS)體外增殖的抑制作用

無菌條件下取接種7～10 d的HepS瘤源小鼠的腹水，加Hanks洗滌，制成單個細胞懸液，1500 rps離心5 min，去上清，將細胞懸浮在5 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基(內含10%小牛血清)中，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度為1×106/mL，加入2塊96孔板中，80 μL/孔。隨后加入用PRMI-1640培養(yǎng)基稀釋的不同濃度皂苷和皂苷元樣品，80 μL/孔，對照孔加RPMI-1640培養(yǎng)基80 μL/孔。將板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內，一塊培養(yǎng)24 h，一塊培養(yǎng)48 h。到時間后每孔加入2.5 mg/mL的MTT 8.5 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 ～6 h，再加入20%SDS 溶液40 μL/孔，培養(yǎng)過夜。次日于酶標儀上，490 nm下測OD值。做三次重復，每組的復孔取均值，并計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率 =(A空白對照-A實驗)/A空白對照×100%

1.2.3.2 海濱錦葵塊根多糖對淋巴細胞體外增殖的影響

于無菌條件下，取雄性17～22 g重小鼠脾臟和胸腺，分別置培養(yǎng)皿中，加Hanks洗滌，在無菌不銹鋼網(wǎng)上研磨，制成單個細胞懸液，1500 rps離心5 min，去上清，將細胞懸浮在5 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基(內含10%小牛血清)中，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度為1×106/mL，加入96孔板，80 μL/孔。隨后加入不同稀釋濃度的純化后的多糖樣品，80 μL/孔，對照孔加 PRMI-1640培養(yǎng)基80 μL/孔。脾臟和胸腺得到的細胞懸液分別同時做兩塊板，一塊板加入25.0 μg/mL 的 ConA40 μL/孔，另一塊板補加RPMI-1640培養(yǎng)基40 μL/孔，觀察細胞增殖反應。將板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。每孔加入2.5 mg/mL的MTT 8.5 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 ～6 h，再加入 20%SDS 溶液 40 μL/孔，培養(yǎng)過夜。次日在酶標儀490 nm下測OD值，以無細胞培養(yǎng)基調零。做三次重復，每組的復孔取均值，并計算細胞生長促進率。

細胞生長促進率 =(A實驗-A空白對照)/A空白對照×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，用SPSS18.0進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 海濱錦葵塊根活性物質提取得率

實驗得到精制的含錦葵塊根皂苷的濃縮液73 mL，經(jīng)檢測濃度為0.61 mg/mL，即皂苷含量為44.53 mg，每克海濱錦葵塊根能提取0.89 mg皂苷(0.89 mg/g);實驗得到粗多糖干重2.55 g(51 mg/g)，粗多糖提取率5.10%。粗多糖經(jīng)由沉淀結合蛋白、DEAE-纖維素柱層析洗脫后，收集三個主要洗脫峰(圖1)，合并洗脫液并旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮液干燥后得到純多糖干重為446 mg。

圖1 粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of polysaccharides by DEAE-cellulose

2.2 海濱錦葵塊根皂苷及皂苷元的體外抑制腫瘤細胞增殖活性

海濱錦葵塊根皂苷及皂苷元對體外培養(yǎng)的HepS細胞增殖的影響結果分別見表1和表2。由表可知，皂苷和皂苷元對HepS腫瘤細胞均有抑制作用，且皂苷元的抑制效果好于皂苷;培養(yǎng)24 h與培養(yǎng)48 h抑制率差別不大;培養(yǎng)24 h情況下，皂苷濃度達到60 μg/mL時，才有顯著抑制效果(P＜0.05)，抑制率10%，而皂苷元在20 μg/mL時，抑制率便達到26.32%，差異極顯著(P＜0.01);皂苷濃度與抑制效果有明顯的量效依賴關系，隨著濃度的增加，抑制效果增強;皂苷元由于在低濃度就能達到很高的抑制效果，量效依賴關系不明顯。

表1 海濱錦葵皂苷對鼠肝癌HepS細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 1 Effects of saponin from Kosteletzkya virginica on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s，n=12)

表1 海濱錦葵皂苷對鼠肝癌HepS細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 1 Effects of saponin from Kosteletzkya virginica on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s，n=12)

注:與對照組相比:1P＜0.05，2P ＜0.01。Note:Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01.

組別Group濃度Concentration(μg/mL)24 h平均A值24 h Average A 24 h抑制率24 h inhibition ratio(%)48 h平均A值48 h Average A 48 h抑制率48 h inhibition ratio(%)對照組Control Group - 0.92±0.07 - 0.86±0.03 -5 0.98±0.08 -6.12 0.66±0.022 23.26 10 0.92±0.05 0.00 0.86±0.07 0.00 20 0.94±0.06 -2.17 0.84±0.03 2.32實驗組Experimental Group 40 0.89±0.02 3.26 0.80±0.022 6.98 60 0.82±0.081 10.87 0.74±0.122 13.95 80 0.72±0.082 21.74 0.66±0.13223.26

表2 海濱錦葵皂苷元對鼠肝癌HepS細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 2 Effects of genipin from Kosteletzkya virginica on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s，n=12)

表2 海濱錦葵皂苷元對鼠肝癌HepS細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 2 Effects of genipin from Kosteletzkya virginica on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s，n=12)

注:與對照組相比:1P＜0.05，2P ＜0.01。Note:Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01.

組別Group濃度Concentration(μg/mL)24h平均A值24h Average A 24h抑制率24h inhibition ratio(%)48h平均A值48h Average A 48h抑制率48h inhibition ratio(%)對照組Control Group - 0.57±0.09 - 0.60±0.13 -5 0.49±0.07 14.04 0.32±0.162 46.67 10 0.58±0.03 -1.75 0.03±0.012 95.00 20 0.42±0.042 26.32 0.12±0.032 80.00實驗組Experimental Group 40 0.04±0.002 92.98 0.07±0.052 88.33 60 0.06±0.012 89.47 0.10±0.022 83.33 80 0.11±0.012 80.70 0.22±0.01263.33

2.3 海濱錦葵塊根多糖的免疫活性

海濱錦葵塊根多糖對正常小鼠胸腺淋巴細胞增殖的影響結果見表3。與空白對照組相比，各濃度塊根多糖樣品在體外都能直接促進小鼠胸腺淋巴細胞的增殖，且效果極顯著(P＜0.01)，隨著濃度的提高，促進效果增強，有明顯的量效依賴關系。塊根多糖與有絲分裂原ConA聯(lián)合刺激胸腺淋巴細胞時，與不添加ConA的實驗組相比，促進效果無太大差異，未見有協(xié)同作用。

表3 海濱錦多糖對胸腺淋巴細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 3 Effects of polysaccharides from Kosteletzkya virginica on thymus lymphocyte proliferation(±s，n=12)

表3 海濱錦多糖對胸腺淋巴細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 3 Effects of polysaccharides from Kosteletzkya virginica on thymus lymphocyte proliferation(±s，n=12)

注:與對照組相比:1P＜0.05，2P ＜0.01。Note:Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01.

組別(24 h)Group濃度Concentration(μg/mL)平均A值Average A促進率Promotion ratio(%)平均A值(加conA)Average A促進率(加conA)Promotion ratio(%)對照組Control Group - 0.37±0.04 - 0.44±0.03 -1.25 1.37±0.572 270.27 1.13±0.782 156.82 2.5 1.59±0.542 329.73 1.77±0.232 302.27 5 1.56±0.542 321.62 1.65±0.182 275.00實驗組Experimental Group 10 1.73±0.292 367.57 1.72±0.182 290.91 20 1.72±0.162 364.86 1.78±0.102304.54

海濱錦葵塊根多糖對正常小鼠脾淋巴細胞增殖的影響結果見表4。與空白對照組相比，在最低濃度1.25 μg/mL時，塊根多糖對脾淋巴細胞體外增殖促進增殖效果顯著(P＜0.05)，其余各濃度組促進效果極顯著(P＜0.01)隨著濃度的提高，促進效果同樣增強，有明顯的量效依賴關系。塊根多糖與有絲分裂原ConA聯(lián)合刺激脾淋巴細胞時，與沒添加ConA的實驗組相比，無太大差異，未見有協(xié)同促進增殖作用。

表4 海濱錦多糖對脾淋巴細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 4 Effects of polysaccharides from Kosteletzkya virginica on spleen lymphocyte proliferation(±s，n=12)

表4 海濱錦多糖對脾淋巴細胞增殖的影響(±s，n=12)Table 4 Effects of polysaccharides from Kosteletzkya virginica on spleen lymphocyte proliferation(±s，n=12)

注:與對照組相比:1P＜0.05，2P ＜0.01。Note:Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01.

組別(24 h)Group濃度Concentration(μg/mL)平均A值Average A促進率Promotion ratio(%)平均A值(加conA)Average A促進率(加conA)Promotion ratio(%)對照組Control Group - 0.48±0.06 - 0.45±0.05 -1.25 1.19±0.511 147.92 1.03±0.561 128.89 2.5 1.18±0.542 145.83 1.45±0.432 222.22 5 1.55±0.192 222.92 1.42±0.462 215.56實驗組Experimental Group 10 1.70±0.062 254.17 1.54±0.572 242.22 20 1.76±0.072 266.67 1.68±0.062273.33

3 討論

海濱錦葵塊根皂苷提取率僅為0.089%，皂苷含量不高;李鵬飛等用水提法提取人參、西洋參總皂苷，提取率分別為6.02%、5.01%［12］。海濱錦葵粗多糖提取率為5.10%;韓真賢等對黃芪多糖進行提取，發(fā)現(xiàn)水提醇沉法的提取率為4.47%［13］;海濱錦葵多糖提取率比黃芪多糖高。不同物種之間的皂苷、粗多糖含量、粗多糖結合蛋白量等有所差異，另外不同的提取方法測定出來的結果也不盡相同。人參、黃芪本就是傳統(tǒng)藥物，其生物活性物質的研究工作已有很多學者報導。因此，就海濱錦葵塊根而言，其活性物質的分離、純化工藝還需進一步研究及改善，通過正交實驗來確定最佳的超聲波功率、處理時間、溫度等等，并盡量減少操作過程中的損耗，從而提高得率、純度。

體外抑制腫瘤細胞增殖活性實驗表明，海濱錦葵塊根皂苷能對HepS腫瘤細胞起到抑制作用，且皂苷濃度與抑制效果有量效依賴關系;皂苷元對HepS的抑制效果強于皂苷，且低濃度皂苷元便有很高抑制效果，所以量效依賴關系不明顯。海濱錦葵塊根多糖對胸腺淋巴細胞及脾淋巴細胞體外增殖的促進效果明顯，量效依賴關系顯著，且與ConA無協(xié)同效應。

以上實驗說明，海濱錦葵塊根皂苷及有一定體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，海濱錦葵塊根多糖具備增強體液免疫力的功效，其具體機理機制有待深入發(fā)掘。本實驗僅是一個初步研究，為合理開發(fā)利用海濱錦葵資源提供依據(jù)。同時為了推進耐鹽油料植物的綜合利用，在改進栽培方式以利生物活性物質積累、改進提取工藝(如用CO2超臨界萃取)以利提高得率等方面再繼續(xù)推進相關研究。

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