深海來源鏈霉菌Streptomyces griseorubens SCSIO ZY0206多酚蒽酮類代謝產(chǎn)物的研究

周 瀟，張 云，黃洪波，宋永相，李 潔，華 燕*，鞠建華*

1西南林業(yè)大學，昆明 650224;2中國科學院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室廣東省海洋藥物重點實驗室中國科學院海洋微生物研究中心中國科學院南海海洋研究所，廣州 510301

過去數(shù)十年，陸生放線菌在藥物先導化合物的發(fā)現(xiàn)中占有絕對優(yōu)勢。但近年來，隨著研究的深入，化合物發(fā)現(xiàn)的重復率不斷增加，從陸生放線菌中尋找新化合物日趨困難，進而，人們將探索的目光轉(zhuǎn)向尚待開發(fā)的海洋。隨著勘探技術(shù)的不斷完善，人們對海洋資源的開采有了突破性進展，從海岸到淺海再到深海，發(fā)現(xiàn)了大量的海洋微生物資源。由于海洋微生物的生存環(huán)境迥異于陸生微生物，因此海洋微生物擁有獨特的遺傳背景和代謝能力，使得其具有生產(chǎn)新穎的化學結(jié)構(gòu)、多樣的生物活性的化合物的能力［1］。目前從海洋微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多大環(huán)內(nèi)酯類、醌類、環(huán)肽類、生物堿類等新穎結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物，多具有抗菌、抗病毒、抗凝、抗炎和抗血小板粘附等藥理作用［2］。因此，發(fā)掘海洋微生物次生代謝產(chǎn)物，可以為先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供新途徑，為藥物研發(fā)注入新的活力。

本課題組致力于海洋放線菌天然產(chǎn)物及其生物合成的研究，近來陸續(xù)從南海海域中發(fā)現(xiàn)了許多放線菌資源，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一系列的抗腫瘤及抗菌天然產(chǎn)物。例如從南海放線菌新屬、新種Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652中發(fā)現(xiàn)了具有耐藥抗瘧原蟲活性的β-咔啉生物堿及吲哚內(nèi)酰胺類生物堿［3］;從南海放線菌 Streptomyces lusitanus SCSIO LR32中分離得到了具有細胞毒活性的角環(huán)素類化合物和芳酰胺類化合物［4，5］等。最近，通過抗菌及鹵蟲致死等生物活性篩選，結(jié)合HPLC-DAD及LC-MS篩選，獲得了一批具有生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物的南海海洋放線菌菌株。其中ZY0206菌株經(jīng)16S分子生物學鑒定為Streptomyces griseorubens，其發(fā)酵提取物顯示出良好的抗菌活性，能抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長。采用硅膠柱層析及半制備高效液相色譜，以濾紙片法抗菌活性檢測對該菌株的次級代謝產(chǎn)物進行了活性跟蹤分離，獲得四個多酚蒽酮類衍生物，經(jīng)HR-ESI-MS、1H及13C NMR、HMBC等波譜技術(shù)分析鑒定為resistoflavine(1)、resistomycin(2)、1-hydroxy-1-norresistomycin(3)和tetracenomycin D(4)。本文報道該放線菌的16S分子生物學鑒定以及化合物1～4的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1 化合物1～4的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-4

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AVANCE DRX 500核磁共振儀(Bruker，500/125 MHz，TMS為內(nèi)標);maXis高分辨質(zhì)譜儀及amaZon SL質(zhì)譜儀(Bruker);ProStar高效液相色譜儀(Varian，配PDA檢測器);YMC-Pack ODS-A半制備色譜柱(250 × 10 mm，5 μm);硅膠薄層層析板(煙臺江友，HSGF254);柱層析用硅膠(煙臺江友，100 ～200目);中壓制備層析系統(tǒng)EZ Purifier III(上海利穗化工科技有限公司);色譜純乙腈(安徽時聯(lián)公司);氘代試劑(CIL);其它化學試劑皆為國產(chǎn)分析純。

放線菌Streptomyces griseorubens SCSIO ZY0206分離自采集于中國南海(E 120°0.250''，N 20°22.971'')3536 m深海海底沉積物樣品，菌種保存于中國科學院海洋微生物研究中心。

種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均用M-AM2ab:豆粉0.5%，酵母粉0.5%，可溶性淀粉2%，細菌學蛋白胨0.2%，海鹽3%，碳酸鈣0.2%，pH 7.2 ～7.4，121℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋鏈霉菌SCSIO ZY0206的分子生物學鑒

1.2.1.1 16S rRNA基因序列的PCR擴增

用細菌16S rRNA的通用引物，27F primer(5'-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3')和1492R primer(5'-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3')，進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):DNA模板0.5 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，27F primer(20 μmol/L)0.5 μL，1492R primer(20 μmol/L)0.5 μL，Tap 酶(5 U·μL)0.2 μL，DMSO 1.25 μL，ddH2O 17.55 μL。PCR 反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性1 min;59℃退火1 min，72℃延伸1.5 min;30個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。

1.2.1.2 擴增產(chǎn)物的序列測定

用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR產(chǎn)物，再連接到pCR2.1載體(Invitrogen)中，16S rRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定。將測出的16S rRNA基因序列進行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過CLUSTALX軟件進行海洋鏈霉菌菌株SCSIO ZY0206及鏈霉菌屬最相似菌株的16S rRNA基因序列的對比，使用軟件MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用M-AM2ab培養(yǎng)基。種子液用250 mL錐形瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，從平板上接入適量菌種，于28℃、200 rpm的搖床上培養(yǎng)36 h后分別轉(zhuǎn)接于2 L錐形瓶，每瓶200 mL培養(yǎng)基，于28℃、200 rpm條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 抗菌活性檢測

取5 mg/mL的DMSO發(fā)酵提取物溶液5 μL，加到濾紙片上，置于含枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis和大腸桿菌Escherichia coli的LB檢測平板，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小，判斷抑菌活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4000 rpm，離心10 min，分離得到上清液和菌絲體部分，上清液經(jīng)丁酮萃取后減壓濃縮得到浸膏A;菌絲體部分先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮層減壓濃縮得到浸膏B，通過HPLC分析，浸膏A和B成分相似，因此合并得到總浸膏16 g。采用正相硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，8∶2，5∶5，V/V)洗脫共得到 8 個組份Fr.1～Fr.8。抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的活性追蹤顯示Fr.2～Fr.6為活性組分，通過HPLC驗證合并后得到組分Fr.2-3和Fr.4-6。對其中Fr.2-3進行常壓正相柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，V/V)洗脫得到 27 個組份，進一步對其中組份Fr.2-3-12～Fr.2-3-19進行半制備HPLC(乙腈-水50% ～95%線性洗脫25 min，流速2.5 mL/min)分離，分別在保留時間為9.8 min和18.0 min處得到化合物1和2;再對其中Fr.4-6進行常壓正相柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，V/V)洗脫得到 30 個組份，F(xiàn)r.B-1～Fr.B-30。通過TLC，HPLC驗證后合并組份得到Fr.B-4～Fr.B21進行常壓正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，99∶1，98∶2，97∶3，96∶4，95∶50，94∶6，V/V)洗脫得到12個組份，F(xiàn)r.BB-1～Fr.BB-12。對其中的組份Fr.BB-5～Fr.BB-11進行半制備HPLC(乙腈-水40% ～90%線性洗脫23 min，流速2.5 mL/min)分離，分別在保留時間為15.7 min和17.4 min處得到化合物4和3。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

16S rRNA基因序列分析表明SCSIO ZY0206與菌株Streptomyces griseorubens NBRC 12780T(AB184139)的16S rRNA基因序列相似性為100%，故該菌株為Streptomyces griseorubens，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的SCSIO ZY0206與其他鏈霉菌菌種NJ分子系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequence showing relationship between strain SCSIO ZY0206 and closely related members of genus Streptomyces

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1深黃色粉末，(-)HR-ESI-MS給出準分子離子峰m/z 391.0823［M-H］-，推測其分子式為 C22H16O7(理論［M-H］-值 391.0823)，不飽和度為15，說明分子中存在大的共軛體系。1H NMR在高場區(qū)有三個甲基單峰質(zhì)子信號;低場區(qū)存在三個苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號及一個活潑氫質(zhì)子的寬單峰信號。13C NMR揭示出三個酮羰基信號，其中兩個為共軛酮羰基;14個芳香碳信號，其中三個為連氧芳碳;另外還存在一個連氧脂肪碳，一個連羰基的脂肪碳以及三個甲基碳信號。通過對照文獻，確定化合物1 的結(jié)構(gòu)為 resistoflavine［6］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 7.30(1H，s，11-OH)，7.03(1H，s，H-8)，6.57(1H，s，H-4)，6.51(1H，s，H-11)，2.70(3H，s，H-14)，1.64(3H，s，H-12)，1.56(3H，s，H-13);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 203.4(C-2)，189.1(C-6)，183.6(C-10)，168.2(C-5，7)，163.8(C-3)，156.6(C-11a)，149.9(C-9)，149.3(C-11c)，148.3(C-11d)，127.6(C-11)，121.0(C-8)，120.5(C-9a)，111.5(C-6a)，108.5(C-5a)，107.5(C-2a)，104.2(C-4)，61.8(C-11b)，46.5(C-1)，30.9(C-14)，24.5(C-12)，23.4(C-13)。

化合物2深黃色粉末，(+)HR-ESI-MS給出準分子離子m/z 377.1038［M+H］+，推測其分子式為C22H16O6(理論［M+H］+值377.1020)，較化合物1少一個氧原子?；衔?的1H NMR和1極為相似，僅少了一個活潑質(zhì)子信號，同時11位質(zhì)子由δH6.51向低場位移至 δH7.23?；衔?的13C NMR與1比較，少了一個共軛羰基和一個連氧脂肪碳信號，多出兩個芳香碳信號。通過與文獻對照，確定化合物2的結(jié)構(gòu)為 resistomycin［7］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 14.62(1H，s，3-OH)，14.41(1H，s，5-OH)，14.17(1H，s，7-OH)，7.23(1H，s，H-11)，7.09(1H，s，H-8)，6.38(1H，s，H-4)，2.94(3H，s，H-14)，1.58(6H，s，H-12，13);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 204.9(C-2)，184.5(C-6)，170.4(C-3)，169.9(C-5)，168.1(C-7)，163.0(C-10)，152.6(C-11a)，152.1(C-9)，139.7(C-11c)，128.5(C-11d)，119.4(C-8)，114.5(C-9a)，110.2(C-11)，107.0(C-11b)，106.5(C-6a)，106.0(C-5a)，102.7(C-2a)100.3(C-4)，46.1(C-1)，28.6(C-14)，25.7(C-12，13)。

化合物3深黃色粉末，(-)ESI-MS給出 m/z 377.3［M-H］-，提示其分子量為378.3，推測其分子式為C21H14O7。化合物3的1H NMR和2相似，僅少了一個甲基的質(zhì)子信號。通過對比文獻，確定化合物 3 的結(jié)構(gòu)為 1-hydroxy-1-norresistomycin［7］。

1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ 7.36(1H，s，H-11)，6.99(1H，s，H-8)，6.29(1H，s，H-4)，2.99(3H，s，H-14)，1.56(3H，s，H-13)。

化合物4淺紅色粉末，(-)ESI-MS給出 m/z 335.3［M-H］-，結(jié)合氫譜及碳譜信息，推測其分子式為C19H12O6。化合物4的1H NMR給出一個芳環(huán)上的甲基質(zhì)子單峰信號δH2.8，兩組苯環(huán)間位質(zhì)子信號，一個苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號，以及兩個活潑質(zhì)子信號δH12.2及14.6。13C NMR給出19個碳信號，其中2個共軛羰基碳信號，16個芳碳信號，以及1個芳環(huán)取代甲基碳信號。查閱文獻，確定化合物為tetracenomycin D［8］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 14.64(1H，s，8-OH)，12.23(1H，s，10-OH)，7.91(1H，s，H-3)，7.18(1H，d，J=2.0，H-4)，7.13(1H，d，J=2.5，H-1)，6.99(1H，d，J=2.0，H-6)，6.57(1H，d，J=2.5，H-11)，2.82(3H，s，7-CH3);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 188.3(C-9)，180.9(C-2)，166.0(C-10)，165.0(C-12)，164.1(C-5)，159.6(C-8)，141.3(C-7)，139.8(C-1a)，135.7(C-3a)，127.8(C-3)，123.3(C-2a)，121.4(C-6)，119.4(C-7a)，111.5(C-4)，109.5(C-9a)，108.0(C-1)，107.9(C-11)，106.4(C-8a)，24.2(C-13)。

2.3 討論

Resistoflavine(1)在鏈霉菌Streptomyces chibaensis AUBN1/7和Streptomyces sp.B8005的代謝產(chǎn)物中均有報道，體外實驗表明，resistoflavine對人胃癌細胞(Cell line HMO2)和肝癌細胞(Cell line HePG2)表現(xiàn)出良好的抑制效果，IC50分別為0.013和0.016 μM，同時對革蘭氏陽性和陰性菌具有弱的抑菌能力［6，7］。Resistomycin(2)生產(chǎn)于鏈霉菌 Streptomyces sp.B8005具有殺菌和引起血管收縮功能，并且可以抑制 RNA和蛋白合成［9］，還被證實具有弱抑制HIV-1 蛋白酶活性，其 IC50為 21 μM［10，11］;resistomycin擁有獨特的平面圓環(huán)特性，通過對resistomycin生物合成途經(jīng)的研究，發(fā)現(xiàn)了編碼resistomycin生物合成基因簇，進一步闡明了在不同的聚酮合酶(PKS)和3個環(huán)化酶(RemI，RemF和RemL)的作用下形成聚酮并在側(cè)鏈發(fā)生環(huán)化，其過程有別于一般的線性或者有一定角度的芳環(huán)聚酮類化合物［12，13］。1-hydroxy-1-norresistomycin是首次報道于鏈霉菌Streptomyces sp.B4842中，具有抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的能力［7］。本項工作首次從南海海洋中分離到了菌株ZY0206，經(jīng)分子生物學鑒定為Streptomyces griseorubens，從其發(fā)酵產(chǎn)物中獲得四個具有多種生物學活性的化合物，為此類化合物的進一步開發(fā)利用提供了菌株資源。

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