離心運動對大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活性及desmin表達影響的研究

白 巍，張海平

離心運動對大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活性及desmin表達影響的研究

白 巍，張海平

（沈陽體育學院運動人體科學學院，遼寧沈陽110102）

目的：從細胞內(nèi)線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運系統(tǒng)入手，探討離心運動對大鼠骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性及desmin表達影響，以期進一步揭示骨骼肌運動性損傷的發(fā)生機制。方法：雄性SD大鼠96只，體重304g±12g，隨機分為安靜對照組、運動后即刻組、運動后12h組、運動后24h組、運動后48h組、運動后72h組、運動后5d組、運動后7d組。采用一次性下坡跑訓(xùn)練建立運動損傷模型，取大鼠肱三頭肌，部分肌肉做desmin免疫組化切片，并進行定量分析；余下肌肉差速離心提取線粒體，測定線粒體各ATP酶活性。結(jié)果：1）離心運動后大鼠骨骼肌desmin表達從運動后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢，以運動后24h下降最為明顯，48h開始回升，第5d達到最高，第7d略有下降，但仍明顯高于安靜對照組。2）離心運動后即刻大鼠骨骼肌細胞線粒體Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和Na＋－K＋－ATPase的活性顯著下降，12h、24h酶活性有所恢復(fù)，仍然明顯低于安靜對照組；48h后各ATP酶結(jié)果與安靜對照組均無顯著差異。結(jié)論：大鼠離心運動后骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性變化與desmin表達之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，線粒體鈣調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致骨骼肌運動損傷的一個重要原因；而離心運動后desmin表達的變化，對骨骼肌運動性損傷形態(tài)學變化的早期界定和損傷恢復(fù)程度的判斷具有重要的參考價值。

離心運動；大鼠骨骼??；線粒體；ATP酶活性；desmin表達

目前，骨骼肌運動損傷的機制有許多學說，包括代謝學說和機械損傷學說等，但無論哪種學說，都與骨骼肌細胞內(nèi)胞漿Ca2＋濃度的變化有關(guān)［1］。在細胞內(nèi) Ca2＋的調(diào)節(jié)中，線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對胞內(nèi)Ca2＋起著持久的、大容量的調(diào)節(jié)，而線粒體Ca2＋含量和ATP酶活性的變化與骨骼肌損傷也有著密切的內(nèi)在聯(lián)系。近年來，學者在探討骨骼肌運動損傷機制的基礎(chǔ)上，對肌肉損傷時細胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)變化等進行了許多研究［2－3］，越來越多的肌肉病理專家認為，了解并掌握骨架蛋白在損傷肌肉中的表達是深刻理解肌肉損傷病理機制的一個重要環(huán)節(jié)。臨床上，常采用細胞骨架蛋白來判斷腫瘤組織來源，或是作為不同種肌病的病理分型依據(jù)，而系統(tǒng)的有關(guān)離心運動后骨架蛋白表達與線粒體ATP酶活性的相關(guān)研究尚不多見，故本研究對揭示骨骼肌運動損傷肌細胞desmin的表達規(guī)律及發(fā)生機制等具有非常重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與分組

雄性SD大鼠96只，體重302g±12g，購于沈陽醫(yī)學院實驗動物中心。大鼠購回后，隨機分為安靜對照組（con）、運動后即刻組（oh）、運動后12小時組（12h）、運動后24小時組（24h）、運動后48小時組（48h）、運動后 72小時組（72h）、運動后5天組（5d）、運動后7天組（7d）。組間動物體重無顯著性差異，實驗前所有動物均未進行過跑臺運動。實驗室溫度（22±3）℃，相對濕度50% ～60%，光照時間：7：00－19：00。

1.2 運動損傷模型

運動損傷模型在在沈陽體育學院國家體育總局重點實驗室內(nèi)進行，采用一次性下坡跑運動訓(xùn)練建立運動損傷模型［4］。實驗前2天，所有動物進行5～10min跑臺運動，速度為5～10m／min，坡度為0°。實驗時，所有運動組動物均進行持續(xù)性下坡跑，速度為16m／min，坡度為－16°，總運動時間為200min，100min運動結(jié)束后，動物休息5min，然后再進行100min運動。

1.3 骨骼肌desmin免疫組化切片制作

骨骼肌desmin免疫組化切片在中國醫(yī)科大學免疫組化實驗室完成。大鼠運動結(jié)束后，各組按不同時間點，腹腔注射戊巴比妥溶液，劑量為0.25～0.5g／kg體重，取右側(cè)肱三頭肌，制作骨骼肌desmin免疫組化切片，試劑盒采用武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。每組切片取6張，按對角線劃分區(qū)域任選取5個視野，顯微鏡下觀察（×400倍），用 motic image 3.0分析軟件進行分析。參數(shù)設(shè)定：目標總面積占圖像視場的百分比：目標總面積占圖像視場的百分比（%）＝（目標總面積÷視野區(qū)域面積）×100%，代表desmin表達。

1.4 骨骼肌細胞線粒體制備［1，5］

稱取1.5克肌組織，在冰浴上剪成碎塊，按重量體積1∶4.5的比例加入事先預(yù)冷的0.25M蔗糖－0.01MTris緩沖液，制備成組織勻漿。勻漿液在高速冷凍離心機內(nèi)經(jīng)差速離心提取線粒體，并置于0.5ml的0.25M蔗糖－0.01MTris緩沖液中待測。以上步驟均在0～4℃環(huán)境中進行。

1.5 大鼠肱三頭肌線粒體ATP酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所提供的超微量ATP酶測試盒和6010紫外－可見分光光度計（安捷倫上海分析儀器廠）。樣品取量及吸光度測定均嚴格按照試劑盒說明書所示程序進行操作。計算公式：組織中ATPase活力（U／mgprot）＝（測定管OD值-對照管OD值）／（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（0.02μmol／ml）×6* ×A** ÷蛋白含量（mgprot／ml）。其中公式中：6*：定義上為每小時，實際操作為l0分鐘反應(yīng)；A**：代表反應(yīng)體系中稀釋的倍數(shù)，其中Ca2＋－ATPase為2.8倍，Ca2＋－Mg2＋－ATPase、Na＋－K＋－ATPase為7.8倍。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)均進行處理，單因素方差分析（ANOVA）進行組間差異顯著性檢驗，顯著性水平為P＜0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 離心運動后大鼠骨骼肌細胞desmin表達影響

表1可以看出，與安靜對照組相比，離心運動后大鼠骨骼肌desmin表達從運動后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢，以運動后24h下降最為明顯（P＜0.05）；48h開始回升，到第5d達到最高，為安靜對照組的114.70%（P＜0.05）；第7d略有下降，但仍明顯高于安靜對照組，為安靜對照組的112.09%（P＜0.05）。

表1 離心運動后不同時刻大鼠骨骼肌desmin表達影響

2.2 離心運動后大鼠骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性變化

表2可以看出，大鼠骨骼肌細胞線粒體Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和 Na＋－K＋－ATPase的活性在離心運動后即刻即顯著下降（P＜0.01），分別下降了52.31%、36.51%和47.19%；12h、24h酶活性有所恢復(fù)，仍然明顯低于安靜對照組（P＜0.01）；48h后各 ATP酶結(jié)果（Ca2＋－Mg2＋－ATPase 48h P＜0.05）與安靜對照組均無顯著差異（P＞0.05），表明ATP酶活性基本恢復(fù)正常。

表2 大鼠離心運動后不同時刻骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性變化

3 討論

在骨骼肌細胞中，desmin為中等徑細胞骨架纖維，對細胞結(jié)構(gòu)的支撐、細胞形狀的決定及細胞機械強度的賦予等有重要作用。高張力的機械牽拉會使細胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響，進而造成肌肉收縮蛋白的結(jié)構(gòu)破壞［6－8］，而 desmin的丟失被認為是骨骼肌運動性微損傷的一個較為敏感的形態(tài)學指標［9－10］。Friden等學者［10］曾對 6名男選手劇烈運動后的股外側(cè)肌進行了活檢，證明了在劇烈運動后有大量的desmin表達。Barash等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠離心收縮后骨骼肌desmin染色下降在離心運動后12h為最明顯。Lieber等研究也證實細胞骨架蛋白的水解是骨骼肌離心收縮損傷的重要原因［12－14］。袁建琴等［15］的研究顯示，骨骼肌 desmin蛋白表達在運動后即刻出現(xiàn)顯著性下降，且與超微結(jié)構(gòu)中Z線等變化相似，也表現(xiàn)出延遲性變化的趨勢。

一般認為，離心運動過程中，骨骼肌desmin的早期丟失是肌節(jié)破壞的證據(jù)，運動后第2天desmin出現(xiàn)升高，意味著肌原纖維開始重建［16－17］。研究表明，desmin在損傷和再生肌肉中的表達存在著一定的規(guī)律［18］。在正常肌纖維中，desmin在肌纖維和靜息衛(wèi)星細胞中有分布；肌肉損傷開始后，desmin表達下降；2天后，desmin表達增加；4天后，達到峰值并持續(xù)到3周之后。從本研究的結(jié)果看，骨骼肌損傷后desmin的表達從運動后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢，并以運動后24h下降最為明顯；48h表達開始增加，到第5天達到最高，隨后略有下降，但到第7天仍明顯高于安靜對照組。結(jié)果表明：離心運動后即刻骨骼肌即由于機械的高張力的作用而出現(xiàn)肌纖維損傷，表現(xiàn)出desmin的丟失，也反映了肌節(jié)的破壞，這種破壞以離心運動后24h最為明顯，48h后desmin表達開始增加，但24h與48h之間沒有明顯差異，表明desmin的丟失與同期電鏡的超微結(jié)構(gòu)改變是基本一致的，后者表現(xiàn)的肌肉損傷的最嚴重程度與前者相比略有延遲。desmin的表達在48h開始增加，第5天達到最高，第7天略降但仍明顯高于安靜對照組，表明可能有新的肌節(jié)逐漸生成，也反映骨骼肌損傷后48h已體現(xiàn)出明顯的修復(fù)過程，這與組織損傷的病理變化過程基本相符。

研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞胞漿內(nèi)Ca2＋增多的程度與肌細胞損傷的程度成正比［4，19］。田野采用非力竭間歇運動和力竭性持續(xù)運動，連續(xù)觀察運動后線粒體鈣含量的變化，發(fā)現(xiàn)兩種負荷運動后線粒體鈣含量的變化趨勢基本一致，表明運動后線粒體聚鈣可能與疲勞的發(fā)展密切相關(guān)［4］。周錦林等采用不同強度的跑臺運動，發(fā)現(xiàn)股四頭肌和腓腸肌線粒體Ca2＋－ATPase活性在大強度運動后略有變化，中等強度運動后顯著下降，表明骨骼肌線粒體Ca2＋－ATPase活性下降可能是造成中等強度長時間運動后骨骼肌疲勞的原因之一［19］。本研究結(jié)果，大鼠離心運動后骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性的下降主要出現(xiàn)在運動后即刻到48h，并以運動后即刻下降最為明顯，48h后各ATP酶活性基本恢復(fù)正常。ATP酶活性的降低，說明離心性負荷所致?lián)p傷過程中線粒體鈣超載引起ATP生成減少，提示在骨骼肌損傷中線粒體鈣超載也是細胞Ca2＋代謝紊亂和細胞損傷的直接原因。而骨骼肌損傷后desmin表達從運動后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢，并以運動后24h下降最為明顯，顯示大鼠離心運動后骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性與desmin表達之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，說明在骨骼肌損傷過程中Ca2＋大量內(nèi)流，造成線粒體鈣超載，過多的鈣抑制線粒體的氧化代謝酶，使線粒體的ATP產(chǎn)生降低，進一步使細胞ATP依賴性離子泵功能下降，細胞內(nèi)離子調(diào)控功能進一步下降，形成惡性循環(huán)；而過多的鈣還可促進組織的自由基產(chǎn)生，促進脂質(zhì)過氧化，使線粒體及離子泵損傷，進而導(dǎo)致或加重骨骼肌損傷。

4 結(jié)論

大鼠離心運動后骨骼肌細胞線粒體ATP酶活性變化與desmin表達之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，線粒體鈣調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致骨骼肌運動損傷的一個重要原因；而離心運動后desmin表達的變化，對骨骼肌運動性損傷形態(tài)學變化的早期界定和損傷恢復(fù)程度的判斷具有重要的參考價值。

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Eccentric Exercise upon Mitochondria ATP Enzymes Activity and Desmin Expression of Skeletal Muscles of Rats

BAI Wei，ZHANG Haiping
（School of Human Sports Science，Shenyang Sport University，Shenyang 110102，Liaoning，China）

Aim：The article studied the influence of eccentric exercise upon mitochondria ATPenzymes activity and desmin expression of skeletal muscles of rats from the angle of Ca2＋transporting system in miotochondria of cell，further discovering the mechanism of exercise-induced muscled damage（EIMD）.Methods：96 SD male rats（weight 304g±12g）were selected as the objects of this study and were randomly divided into groups of peaceful contrast（con）at 0h，12h，24h，48h，72h，5d，7d after exercise according to the time when the rats were killed.The model of injury was a bout of exhaustive eccentric exercise on a treadmill.Triceps brachiies were drawn for the immunohistochemical specimens of desmin and extracting of miotochondria.The immunohistochemical specimens of desmin were analyzed quantitatively under microscope.Miotochondria were extracted by the method of centrifugation at different speed and their activity were measured.Results：1）The expression of desmin of rats’skeletal muscles had a gradual descending tendency from the instant to 24 hour after eccentric exercise，and the descent at 24 hour was the most evident.From 48h，the expression began to increase and reached the top at 5d，then slightly decreased at 7d and its value was higher obviously than that of con.2）The activities of Ca2＋-ATPase，Ca2＋-Mg2＋-ATPase and Na＋-K＋-ATPase in miotochondria decreased obviously from the instant after eccentric exercise，the activities of ATPases of 12h and 24h increased slightly but were still lower obviously than that of con.The activities of ATPases of 48h and later time were not different obviously with that of con.Conclusions：The changes of mitochondria ATPenzyme’s activity were related closely to desmin’s expression of skeletal muscles of rats after eccentric exercise.The unbalance of Ca2＋regulation in mitochondria was an important reason of EIMD.The changes of desmin’s expression after eccentric exercise had a important reference value for the earlier injury diagnosis and the recovery’s judgment of EIMD.

eccentric exercise；skeletal muscles of rats；mitochondria；the activities of ATPases；desmin expression

G804.7

A

1004－0560（2013）02－0086－03

2012-09-07；

2012-11-26

遼寧省教育廳高?？茖W研究項目（20060850）。

白 ?。?956－），男，副教授，主要研究方向為運動解剖學。

張海平（1964－），男，教授，博士，主要研究方向為運動對骨骼肌形態(tài)和機能的影響。E－mail：Zhping2000＠126.com。

責任編輯：喬艷春