1,25-二羥維生素D3負性調(diào)控被動致敏人氣道平滑肌細胞中的NF-κB信號通路*

宋穎芳， 賴國祥， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350025)

1,25-二羥維生素D3負性調(diào)控被動致敏人氣道平滑肌細胞中的NF-κB信號通路*

宋穎芳， 賴國祥△， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350025)

目的探討1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]對被動致敏人氣道平滑肌細胞(HASMCs)中核因子κB(NF-κB)信號通路的影響。方法原代培養(yǎng)HASMCs并使之被動致敏，以1,25-(OH)2D3作為干預(yù)因素。EMSA法檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性；免疫細胞化學(xué)染色技術(shù)觀察NF-κB p65的核易位情況；Western blotting法檢測核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表達水平；實時熒光定量PCR檢測維生素D受體(VDR)、維生素D 24-羥化酶(CYP24)和IκBα mRNA的表達水平；放線菌素D處理實驗檢測IκBα mRNA的表達。結(jié)果(1) 1,25-(OH)2D3顯著削弱被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性及其亞單位 p65的核易位；(2) 1,25-(OH)2D3能通過增加被動致敏HASMCs中IκBα的mRNA穩(wěn)定性及減少其蛋白磷酸化水平2個途徑顯著上調(diào)細胞中IκBα的表達；(3) 1,25-(OH)2D3顯著上調(diào)被動致敏HASMCs中VDR的mRNA表達并誘發(fā)其功能性反應(yīng)。結(jié)論1,25-(OH)2D3能通過上調(diào)被動致敏HASMCs中IκBα的表達抑制細胞NF-κB信號通路，且這一作用與VDR有關(guān)，這可能是其調(diào)控被動致敏HASMCs的重要作用機制。

哮喘； 氣道平滑肌細胞； 1,25-二羥維生素D3； 核因子κB； 受體,維生素D

氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的表型改變是支氣管哮喘(簡稱哮喘)氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。核因子κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，近年來被證實是調(diào)控ASMCs細胞表型改變的關(guān)鍵性調(diào)控因子[1]。1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2D3]是體內(nèi)維生素D(vitamin D, Vit D)最重要的活性代謝產(chǎn)物。本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3能抑制人氣道平滑肌細胞(human airway smooth muscle cells，HASMCs)的表型改變[2]。但這種調(diào)節(jié)作用的具體機制尚不明確。本研究探討1,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中NF-κB信號通路的影響，旨在明確其調(diào)節(jié)被動致敏HASMCs的可能作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

HASMCs (ScienCell)；放線菌素D(Sigma)；DMEM液(Gibco)； SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；抗NF-κB p65、抗IκBα、抗p-IκBα抗體及ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz)，NE-PERTM試劑盒(Pierce)，Gel Shift Assay Systems試劑盒(Promega)，F(xiàn)astStart SYBR GreenⅠ試劑盒(Roche)。

2HASMCs的培養(yǎng)及分組

HASMCs予以含10%胎牛血清的高糖DMEM液在5%CO2、37 ℃孵箱內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，實驗用4～8代細胞。參照文獻[3]予以制備對照血清及哮喘血清。按隨機排列表法將細胞分成3組：(1)對照組：無血清DMEM液同步化48 h后，用10%對照血清處理HASMCs；(2)哮喘組：無血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs；(3) Vit D組：用含10-7mol/L 1,25-(OH)2D3的無血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs。各組均于血清刺激1 h后進行以下實驗。

3電泳遷移率變動分析(electrophreticmobilityshiftassay,EMSA)法檢測各組HASMCs中的NF-κB活性

使用NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs的核蛋白，按Gel Shift Assay Systems試劑盒提供的說明書標(biāo)記NF-κB寡核苷酸探針(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’；3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’)，并進行DNA結(jié)合反應(yīng)，隨后行5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后干膠，置于-70 ℃放射自顯影；圖像分析軟件測量各樣品電泳滯后帶的相對吸光度(A)。

4免疫細胞化學(xué)法檢測各組HASMCs中NF-κBp65核移位情況

甲醛固定細胞，用1∶1 000稀釋羊抗人NF-κB p65抗體作為Ⅰ抗，按SABC試劑盒說明進行SABC法染色，以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。NF-κB p65的陽性表達呈棕黃色顆粒，可位于細胞質(zhì)和細胞核。顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野，計數(shù)胞核陽性表達細胞數(shù)并計算胞核陽性率。

5Westernblotting法檢測各組HASMC中的IκBα和p-IκBα的表達

NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs總蛋白，10% SDS-PAGE分離樣品細胞總蛋白并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用1∶1 000稀釋的抗IκBα和p-IκBα抗體分別進行蛋白印記分析，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統(tǒng)確定各蛋白條帶的相對灰度值。

6實時熒光定量PCR檢測各組HASMCs中維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)、維生素D24-羥化酶(vitaminD24-hydroxylase,CYP24)和IκBαmRNA的表達

Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后取2 μL cDNA作為反應(yīng)模板進行PCR擴增。各目的基因引物見表1。PCR反應(yīng)條件：VDR：95 ℃ 20 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，38個循環(huán)；CYP24：95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；IκBα：95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；GAPDH：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動記錄每個樣品管中的熒光強度增加到熒光閾值所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)(Ct)。以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的基因mRNA的相對含量[目的基因mRNA/GAPDH mRNA=2-ΔCt(ΔCt =Cttarget-CtGAPDH)]。每組設(shè)3個復(fù)孔。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

7放線菌素D處理實驗測定各組HASMCs中IκBαmRNA的表達

給予10 mg/L的放線菌素D處理細胞，以終止基因轉(zhuǎn)錄。分別于作用0、1、2、3、4、5和6 h后提取細胞RNA并采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞IκBα mRNA的表達。

8統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS 16.0軟件進行One-way ANOVA檢驗和SNK-q檢驗進行兩兩間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

11,25-(OH)2D3對NF-κBDNA結(jié)合活性的影響

與對照組相比，哮喘組HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯升高，其電泳滯后帶的相對A值是對照組的(7.78±0.53)倍(P<0.05)；而1,25-(OH)2D3顯著抑制了被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性，其電泳滯后帶的相對A值僅是對照組的(5.18±0.31)倍，與哮喘組比較差異顯著(P<0.05)，見圖1。

21,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中NF-κBp65核移位的影響

Figure 1. Inhibition of NF-κB DNA-binding activity in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3.1: non-specific competition; 2: specific competition; 3: control group; 4: asthma group; 5: Vit D group.

圖11,25-(OH)2D3抑制被動致敏HASMCs中NF-κBDNA結(jié)合活性

對照組細胞中可見NF-κB p65陽性產(chǎn)物棕黃色顆粒，主要分布在細胞質(zhì)中，其胞核陽性率為(13.24±3.58)%；哮喘組陽性表達顆粒明顯增加，且在胞核內(nèi)明顯增加，其胞核陽性率較對照組明顯增高，為(42.76±4.79)% (P<0.05)；而Vit D組陽性表達顆粒核內(nèi)增加不明顯，較為均勻地分布于胞質(zhì)及胞核中，其胞核陽性率為(25.58±5.43)%，較哮喘組有所下降(P<0.05)，但仍高于對照組,見圖2。

Figure 2. Inhibition of nuclear translocation of NF-κB p65 in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3(DAB,×400).A: control group; B: asthma group; C: Vit D group.

圖21,25-(OH)2D3抑制被動致敏HASMCs中NF-κBp65的核移位

31,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中IκBα蛋白表達水平的影響

Vit D組IκBα蛋白表達量(0.27±0.04)較哮喘組(0.15±0.03)明顯增高，但兩者均低于對照組(0.42±0.05)(P<0.05)，即1,25-(OH)2D3能上調(diào)哮喘狀態(tài)下HASMCs中IκBα的蛋白表達,見圖3。

Figure 3. 1,25-(OH)2D3increased IκBα protein expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsasthma group.

圖31,25-(OH)2D3增加被動致敏HASMCs中IκBα蛋白的表達

41,25-(OH)2D3對IκBαmRNA表達的影響

哮喘血清中IκBα的mRNA 半衰期為(192.91±8.33)min，而Vit D的預(yù)處理可使其半衰期延長至(264.13±10.76)min。由此可見1,25-(OH)2D3能顯著增強細胞中IκBα mRNA的表達水平，這是1,25-(OH)2D3上調(diào)IκBα蛋白表達的主要原因,見圖4。

Figure 4. 1,25-(OH)2D3IκBα mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.

圖41,25-(OH)2D3增加被動致敏HASMCs中IκBαmRNA的表達

51,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs總蛋白中p-IκBα表達水平的影響

IκBα蛋白的降解是影響IκBα蛋白表達的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先決條件。圖3顯示，1,25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中p-IκBα的蛋白表達。為排除IκBα的表達水平對p-IκBα表達的影響，實驗用IκBα蛋白表達量對p-IκBα蛋白表達量進行標(biāo)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vit D組p-IκBα/IκBα為0.41±0.05，亦顯著低于哮喘組的0.86±0.04 (P<0.05)，但仍高于對照組的0.17±0.03 (P<0.05)。由此可見1,25-(OH)2D3能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制其蛋白降解，這是1,25-(OH)2D3上調(diào)IκBα蛋白表達的另一重要原因。

6各組細胞中VDR及CYP24mRNA的表達

哮喘組及對照組僅有極低水平的VDR及CYP24 mRNA表達，且2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而1,25-(OH)2D3明顯上調(diào)了這2個目的基因的mRNA表達水平(P<0.01)，見圖5。這一結(jié)果不僅證實了VDR在HASMCs中的表達，而且還說明1,25-(OH)2D3能有效上調(diào)HASMCs中VDR的表達并誘發(fā)其功能性反應(yīng)。

Figure 5. 1,25-(OH)2D3increased VDR (A) and CYP24 (B) mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsasthma group.

圖5各組HASMCs中VDR及CYP24mRNA的水平

討 論

1,25-(OH)2D3主要通過與VDR的結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。隨著VDR被明確為哮喘的易感基因，1,25-(OH)2D3對哮喘的調(diào)節(jié)作用受到越來越廣泛的關(guān)注[4]。ASMCs的細胞表型改變是哮喘氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，目前已成為哮喘氣道重塑研究及治療的重要標(biāo)靶。本課題組的前期研究首次發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3能抑制哮喘狀態(tài)下HASMCs的高增殖狀態(tài)并抑制其表達基質(zhì)金屬蛋白酶9，從細胞水平初步揭示了1,25-(OH)2D3調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑的能力[2]。Damera等[5]亦證實1,25-(OH)2D3能抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的HASMCs增殖，并指出這種抑制作用是通過1,25-(OH)2D3對細胞檢測點激酶1和Rb蛋白的磷酸化來實現(xiàn)。但這種作用機制并不足以解釋1,25-(OH)2D3對HASMCs表達MMP-9的抑制作用，因此1,25-(OH)2D3勢必存在其它信號通路來同時調(diào)控HASMCs的增殖和MMP-9的表達。

NF-κB信號通路是哮喘發(fā)病機制中最受關(guān)注的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其在哮喘患者氣道中被過度活化[6]?，F(xiàn)已明確，NF-κB的活化須具備2個條件：(1)與IκB的解離；(2) NF-κB的核移位。故判斷NF-κB的活性水平時應(yīng)強調(diào)以下2點：NF-κB的核移位和IκB的降解水平。

本研究不僅用經(jīng)典的EMSA法證實1,25-(OH)2D3能顯著抑制被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性，而且還用免疫細胞化學(xué)染色法直觀地證實1,25-(OH)2D3能有效地抑制細胞中NF-κB的核移位。IκB是NF-κB的主要抑制蛋白, 在已知的IκB家族成員中，IκBα與NF-κB活化關(guān)系最為密切，其含量的變化能間接反應(yīng)NF-κB的活化程度。本研究亦證實1,25-(OH)2D3能通過增加被動致敏HASMCs中IκBα mRNA的表達及減少其磷酸化水平而顯著上調(diào)細胞中IκBα的表達，即抑制IκBα的降解。上述結(jié)果說明1,25-(OH)2D3具有抑制被動致敏HASMCs中NF-κB活化的能力。

鑒于NF-κB是調(diào)節(jié)哮喘狀態(tài)下ASMCs功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，有理由認為1,25-(OH)2D3對HASMCs中NF-κB活化的這種抑制作用在其調(diào)節(jié)HASMCs的功能中扮演著重要的角色，這不僅為拓展1,25-(OH)2D3在哮喘治療中的臨床應(yīng)用提供了最基礎(chǔ)的理論依據(jù)；而且還為臨床治療哮喘(尤其是難治性哮喘)、慢性阻塞性肺疾病等ASMCs過度增殖性疾病開辟了新的研究平臺。

業(yè)已證實，1,25-(OH)2D3的生物學(xué)效應(yīng)與靶組織中的VDR含量直接相關(guān)，它可通過增強VDR蛋白的穩(wěn)定性等多種方式上調(diào)VDR的表達[7]。而VDR是NF-κB活性調(diào)控中的重要上游分子：VDR不僅能直接上調(diào)IκBα的表達并增強IκBα的穩(wěn)定性[8]，而且還與NF-κB的亞單位 p65存在生理性結(jié)合，通過直接阻礙p65的核易位及其與DNA的結(jié)合活性等方式來直接抑制NF-κB p65的活性[9]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)在胚胎成纖維細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞及樹突細胞等多種細胞中，1,25-(OH)2D3正是借由與VDR的受體配體效應(yīng)來調(diào)節(jié)NF-κB信號通路進而細胞特異性地調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)功能[10-11]。有意思的是，本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)VDR存在于HASMCs上，且1,25-(OH)2D3能顯著上調(diào)被動致敏HASMCs中VDR的mRNA水平并誘發(fā)其功能性反應(yīng)，結(jié)合本實驗中1,25-(OH)2D3調(diào)節(jié)NF-κB活性研究的相關(guān)結(jié)果，推測1,25-(OH)2D3對HASMCs中NF-κB的抑制作用可能也是VDR依賴性的，后續(xù)的實驗將對這一可能作用機制進行深入研究。

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1,25-dihydroxyvitaminD3inhibitsnuclearfactorkappaBsignalingpathwayinpassivelysensitizedhumanairwaysmoothmusclecells

SONG Ying-fang, LAI Guo-xiang, LIU De-ling, LIN Qing-an, LIAO Yun-hai

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou350025,China.E-mail:laiguoxiang2007@163.com)

AIM: To investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25-(OH)2D3] on nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway in passively sensitized human airway smooth muscle cells (HASMCs).METHODSHASMCs were passively sensitized with 10% serum from asthmatic patients. 1,25-(OH)2D3was used as an interfering factor. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect the DNA-binding activity of NF-κB. Immunocytochemical staining was used to observe the nuclear translocation of NF-κB p65. Western blotting was used for IκBα and phosphorylated IκBα protein detection. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine vitamin D receptor (VDR), vitamin D 24-hydroxylase (CYP24) and IκBα mRNA expression. The mRNA expression of IκBα in HASMCs after actinomycin D treatment was also determined.RESULTS(1) 1,25-(OH)2D3significantly attenuated the DNA-binding activity of NF-κB and the nuclear translocation of NF-κB p65 in HASMCs passively sensitized by asthmatic serum. (2) 1,25-(OH)2D3enhanced IκBα mRNA stability and inhibited IκBα protein phosphorylation in passively sensitized HASMCs, thus increasing IκBα expression in these HASMCs. (3) 1,25-(OH)2D3up-regulated VDR mRNA level and evoked its functional response in passively sensitized HASMCs.CONCLUSION1,25-(OH)2D3enhanced the expression of IκBα and therefore inhibited NF-κB signaling passway in HASMCs. This effect may be dependent on VDR, and responsible for the inhibitory effect of 1,25-(OH)2D3on passively sensitized HASMCs.

Asthma; Airway smooth muscle cells; 1,25-Dihydroxyvitamin D3; Nuclear factor kappa B; Receptors, vitamin D

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.023

1000- 4718(2013)11- 2044- 05

2013- 03- 21

2013- 08- 23

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81100011)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2011J05087)

△通訊作者 Tel: 0591-22859333； E-mail: laiguoxiang2007@163.com