脂肪特異性蛋白27對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化的影響*

俞富祥， 宋才鑫， 吳志偉， 張啟瑜

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 溫州 325000)

脂肪特異性蛋白27對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化的影響*

俞富祥， 宋才鑫， 吳志偉， 張啟瑜△

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 溫州 325000)

目的探討脂肪特異性蛋白27(Fsp27)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖和活化的影響及其對(duì)纖維化相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用。方法從SD大鼠肝臟提取HSCs并培養(yǎng)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光染色和Western blotting檢測(cè)原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表達(dá)。構(gòu)建攜帶Fsp27基因的慢病毒，轉(zhuǎn)染活化的HSCs并繼續(xù)培養(yǎng)72 h，通過CCK-8比色法檢測(cè)Fsp27對(duì)HSCs增殖的影響；Western blotting檢測(cè)HSCs中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，了解HSCs的活化狀態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Fsp27對(duì)HSCs中纖維化相關(guān)蛋白[包括基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)] mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果成功分離大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表達(dá)差異顯著(P<0.01)；活化HSCs成功轉(zhuǎn)染攜帶Fsp27基因的慢病毒后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，與對(duì)照組比較，HSCs的活化與增殖被明顯抑制(P<0.05)；Fsp27促進(jìn)MMP-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，降低TIMP-1和TGF-β1mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化，并調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。Fsp27的作用可能與其維持HSCs靜息狀態(tài)細(xì)胞表型有關(guān)。

脂肪特異性蛋白27； 肝星狀細(xì)胞； 活化

眾所周知，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。HSCs增殖激活后可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，引起膠原纖維沉積導(dǎo)致纖維化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻斷肝纖維化肝硬化的進(jìn)程[1-4]。針對(duì)HSCs的有關(guān)肝纖維化機(jī)制及對(duì)其防治的研究近年已成為國(guó)內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

HSCs活化的一個(gè)重要特征是胞漿內(nèi)脂滴的消失。現(xiàn)有針對(duì)脂肪細(xì)胞的研究提示脂肪特異性蛋白27(fat-specific protein 27，F(xiàn)sp27)是脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴形成的一個(gè)重要蛋白，其基因在肝臟中是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的直接靶基因，脂肪細(xì)胞儲(chǔ)脂功能的實(shí)現(xiàn)主要通過Fsp27而實(shí)現(xiàn)[5]。另外有研究通過導(dǎo)入外源基因PPARγ在HSCs中表達(dá)，顯示PPARγ可使HSCs由活化態(tài)向靜止態(tài)轉(zhuǎn)變。在本研究中，我們?cè)鰪?qiáng)Fsp27在活化HSCs中的表達(dá)，以了解Fsp27能否對(duì)HSCs活化增殖過程產(chǎn)生影響。

材 料 和 方 法

1材料及試劑

健康6周齡雄性SD大鼠10只，體重200～300 g，供分離原代HSCs，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；L-DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自HyClone；小牛血清購(gòu)自Gibco；Ⅳ型膠原酶、DNaseⅠ購(gòu)自Sigma；OptiPrep分離液購(gòu)自Axis Shield；6孔塑料培養(yǎng)板購(gòu)自Millipore；鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購(gòu)自Southern-Biotech；AEC試劑盒購(gòu)自博士德生物公司。RNA Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

2方法

2.1HSCs的分離、培養(yǎng) 使用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法，即膠原酶原位灌注及密度梯度離心技術(shù)從大鼠分離提取原代HSCs。原代細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定(原代HSCs活化后表達(dá)α-SMA)，HSCs純度可達(dá)95%。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中, 37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%小牛血清的L-DMEM，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d換液1次。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照試劑盒說明，PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性15 s后，按95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，共45個(gè)循環(huán)。Fsp27上游引物5’-CCTCTATGACACATACTCGCTTTC-3’，下游引物5’-TGTTCTTCCTCAGTGGCATCC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度168 bp。GAPDH上游引物5’-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3’，下游引物5’-GGATGGAATTGTGAGGGAGA -3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度215 bp。

2.3Western blotting 在原代HSCs及活化HSCs中分別加入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫?fù)u床振蕩1 h，加入I抗體α-SMA (1∶100)，4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，孵育II抗(1∶30 000)，37 ℃恒溫振搖1 h；TBST漂洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，對(duì)膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel-Pro Analyzer分析目標(biāo)帶的灰度值。

2.4免疫熒光染色 原代細(xì)胞爬片48 h后PBS漂洗，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜；PBS漂洗3次后0.1%Triton X-100處理15 min；PBS漂洗，10%山羊血清封片20 min；于4 ℃標(biāo)記I抗過夜，次日PBS漂洗并室溫標(biāo)記II抗1 h，然后漂洗、封片，上機(jī)觀測(cè)。

2.5攜帶Fsp27基因的慢病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞感染 構(gòu)建的重組體慢病毒(pLV-Fsp27)包含鼠Fsp27基因及GFP基因，該病毒的滴定度測(cè)定為2.00×1011TU/L。病毒被儲(chǔ)存在-80 ℃，病毒增殖分離在293T細(xì)胞中進(jìn)行。慢病毒感染后的HSCs進(jìn)行下游檢測(cè)時(shí)狀態(tài)良好。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞株HSC-T6中進(jìn)行。在不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)下進(jìn)行慢病毒感染。HSCs培養(yǎng)于6孔板中，密度為5×104cells/well，每孔以MOI=0、20和40轉(zhuǎn)染重組體慢病毒(pLV-Fsp27)或空載病毒(pLV-GFP)。感染72 h后根據(jù)GFP的表達(dá)情況及Fsp27 mRNA的檢測(cè)，測(cè)算感染效率。

2.6目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞表型及細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為空白對(duì)照組(無病毒轉(zhuǎn)染)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pLV-GFP)及陽(yáng)性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pLV-Fsp27)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按前述方法將帶目標(biāo)基因的慢病毒轉(zhuǎn)染HSCs后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞表型的變化。每孔加入CCK-8溶液80 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)每孔的吸光度(A)，根據(jù)公式[增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%]計(jì)算陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組的增殖抑制率。

2.7目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞活化的影響 將帶目標(biāo)基因的慢病毒轉(zhuǎn)染活化HSCs，觀察HSCs α-SMA表達(dá)的變化。慢病毒轉(zhuǎn)染HSCs后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按前述方法提取蛋白，采用Western blotting測(cè)定α-SMA的表達(dá)情況。

2.8目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染后對(duì)HSCs的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 帶目標(biāo)基因的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，設(shè)計(jì)大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及內(nèi)參照GAPDH的引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別測(cè)定各組細(xì)胞中上述蛋白的mRNA表達(dá)情況。具體如下：MMP-2上游引物5’-CCCCTATCTACACCTACACCAA-3’,下游引物5’-CACCACGGATCTGAGCAAT-3’,擴(kuò)展片段長(zhǎng)192 bp； TIMP-1上游引物5’-CCTCTGGCATCCTCTTGTTG-3’,下游引物5’-CGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)157 bp；TGF-β1上游引物5’-GAGGCGGTGCTCGCTTTGT-3’,下游引物5’-CGGGTGACTTCTTTGGCGTAG-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)107 bp；GAPDH上游引物5’-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3’,下游引物5’-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)215 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：94 ℃ 30 s，56 ℃(MMP-2和TIMP-1為52.1 ℃)30 s，72 ℃ 45 s。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)間的比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1HSCs的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

每只大鼠HSCs的獲得率約為(1～2)×107，臺(tái)盼藍(lán)染色存活細(xì)胞>95%。相差顯微鏡下，剛分離出來的HSCs呈圓球形，胞漿內(nèi)含較多脂肪小滴，在328 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下，熒光顯微鏡可觀察到藍(lán)綠色熒光的脂滴。培養(yǎng)2～3 d后，細(xì)胞貼壁；5～8 d后，細(xì)胞伸展呈星形。10 d后HSCs幾乎全部活化(胞漿內(nèi)可見棕色的α-SMA),見圖1。

Figure 1. Identification of hepatic stellate cells (HSCs). A: primary HSCs at 2 d (×1 000); B: primary HSCs at 3 d (×100); C: activated HSCs (α-SMA immunocytochemical staining，×300).

圖1肝星狀細(xì)胞的鑒定

2Fsp27在原代及活化HSCs中的表達(dá)

Fsp27蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿脂滴包膜，在原代HSCs中無論mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均為顯著表達(dá)，而在活化的HSCs中Fsp27則幾乎不表達(dá)，兩者差異顯著(P<0.01),見圖2。

3攜帶Fsp27基因的慢病毒轉(zhuǎn)染HSCs結(jié)果

成功構(gòu)建攜帶Fsp27基因的慢病毒(pLV-Fsp27)。HSCs經(jīng)慢病毒感染后，在顯微鏡下可見綠色熒光，顯微鏡下熒光觀察感染效率達(dá)到80%以上。pLV-Fsp27組中該Fsp27 mRNA強(qiáng)表達(dá)，而在空白對(duì)照組和pLV-GFP組中幾乎不表達(dá)(P<0.01),見圖3。

Figure 2. Expression of Fsp27 mRNA and protein in primary HSCs and activated HSCs. A: expression of Fsp27 protein in HSCs (immunofluorescence staining, ×200);B: Fsp27 mRNA expression in HSCs detected by real-time fluorescence quantitative PCR; C: expression of Fsp27 protein in HSCs detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsactivated HSCs.

圖2原代及活化HSCs中Fsp27的表達(dá)

4Fsp27抑制HSCs增殖并引起HSCs表型的變化

光學(xué)顯微鏡下觀察，與空白對(duì)照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組細(xì)胞形態(tài)變小，胞漿變少，樹突狀胞突變短，形態(tài)更接近于原代HSCs。與pLV-GFP組相比，病毒轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，pLV-Fsp27組HSCs增殖活性受抑制明顯，且與病毒劑量相關(guān)(P<0.05)。在MOI=40時(shí)，隨著時(shí)間推移，與pLV-GFP組相比，pLV-Fsp27組HSCs的增殖抑制率顯著增大(P<0.05),見圖4。

Figure 3. Infection efficiency and Fsp27 mRNA expression in activated HSCs after lentivirus infection. A: cell morphology and GFP expression observed under phase-contrast microscope and fluorescence microscope, respectively (×200); B: expression of Fsp27 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control or pLV-GFP.

圖3活化HSCs感染慢病毒后的感染效率和Fsp27mRNA表達(dá)

5Fsp27抑制HSCsα-SMA的表達(dá)

與空白對(duì)照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組HSCs內(nèi)α-SMA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。而pLV-GFP組與空白對(duì)照組中HSCs的α-SMA的表達(dá)則無顯著差異(P>0.05),見圖5。

6Fsp27調(diào)節(jié)了肝纖維化相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)

與空白對(duì)照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組中抗纖維化的MMP-2 mRNA表達(dá)升高，促纖維化的TIMP-1及TGF-β1mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

討 論

我國(guó)是肝炎高發(fā)國(guó)家，肝炎繼續(xù)發(fā)展形成肝硬化，由肝硬化導(dǎo)致的肝功能衰竭或肝癌是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，現(xiàn)已成為影響人民健康的重要因素。因此，阻斷或延緩肝纖維化的發(fā)展是目前治療肝硬化的關(guān)鍵。有研究顯示肝纖維化是一個(gè)可逆轉(zhuǎn)的疾病，是治療肝硬化的一個(gè)重要靶點(diǎn)[1-4，6]。

HSCs屬于肝臟的間質(zhì)細(xì)胞，它在肝臟中的生理功能主要為參與維生素A 的代謝，儲(chǔ)存脂肪，為肝細(xì)胞提供能源。在病理?xiàng)l件下如肝臟受到外源性刺激時(shí)，HSCs增殖并激活，激活的HSCs一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，對(duì)肝纖維化的形成起著至關(guān)重要的作用，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)升高，門靜脈血液回流受阻，肝臟缺血缺氧加重，又進(jìn)一步促進(jìn)肝損傷和肝硬化的發(fā)展。由此可見，HSCs的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-4]。

Figure 4. Changes of the morphology and proliferation of activated HSCs after pLV-Fsp27 infection. A: cell morpho-logy observed under phase-contrast microscope (×200); B～D: cell viability detected by CCK-8 assay, including 48 h after infection at different MOI (B), 72 h after infection at different MOI (C) and different time after infection at MOI=40 (D). Mean±SD.n=6.*P<0.05vspLV-GFP.

圖4活化HSCs感染pLV-Fsp27后形態(tài)與增殖的變化

Figure 5. Effect of Fsp27 on α-SMA expression in activated HSCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control or pLV-GFP.

圖5活化HSCs感染pLV-Fsp27后α-SMA表達(dá)的變化

Figure 6. Effects of Fsp27 on MMP-2,TGF-β1and TIMP-1 mRMA expression in activated HSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank control or pLV-GFP.

圖6活化HSCs感染pLV-Fsp27后MMP-2、TGF-β1和TIMP-1mRMA表達(dá)的變化

PPARγ是維持HSCs靜息狀態(tài)的重要細(xì)胞因子，在原代HSCs中高表達(dá)，而在活化的HSCs中低表達(dá)，甚至不表達(dá)。通過外源性增加HSCs中PPARγ的激動(dòng)劑或病毒轉(zhuǎn)染外源基因使PPARγ高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPARγ不僅能顯著抑制活化HSCs的活化與增殖，而且能有效抑制活化后HSCs的致炎因子及膠原纖維的分泌，從而能逆轉(zhuǎn)活體肝纖維化進(jìn)程[6-11]。

雖然HSCs中PPARγ的功能研究報(bào)道較多，但其具體作用機(jī)制尚不十分明晰。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子(cell death-inducing DFF45-like effectors，CIDE)家族是近幾年發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的一組新蛋白，在細(xì)胞凋亡、脂肪和能量代謝方面具有明顯的作用[12]。Fsp27是CIDE家族蛋白中的一員，在成熟脂肪細(xì)胞特異表達(dá)，其在脂肪組織的分化和形成過程中可能具有重要的作用。Fsp27是一種脂肪液滴結(jié)合蛋白，并且會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂類物質(zhì)的堆積，其基因是PPARγ的直接靶基因[5-6]。HSCs是肝臟中的儲(chǔ)脂細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)Fsp27在原代HSCs高表達(dá)，而在活化HSCs中幾乎不表達(dá)。通過Fsp27特異性抗體免疫熒光染色還發(fā)現(xiàn)，該蛋白特異性表達(dá)于脂肪滴包膜，對(duì)HSCs胞漿中脂滴的形成與維持可能具有重要作用。

我們通過慢病毒載體感染技術(shù)，使Fsp27在活化HSCs中得以表達(dá)。與對(duì)照組比較，F(xiàn)sp27明顯抑制HSCs增殖，同時(shí)也抑制了HSCs的活化，還促進(jìn)了抗纖維化蛋白MMP-2的mRNA表達(dá)，降低了促纖維化蛋白TIMP-1及TGF-β1的mRNA表達(dá)。由此可見，F(xiàn)sp27可能也是維持HSCs靜息狀態(tài)細(xì)胞表型及生物活性的重要調(diào)控因子之一，有望成為抗肝纖維化治療的靶點(diǎn)之一。

總之，目前初步的研究成果顯示，F(xiàn)sp27可抑制HSCs活化、增殖，促進(jìn)了抗纖維化蛋白 MMP-2的表達(dá)。但是Fsp27在HSCs中的具體作用通路及PPARγ對(duì)HSCs的作用是否是通過Fsp27途徑等問題目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道甚少，有待進(jìn)一步深入研究。

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Effectoffat-specificprotein27onactivationofrathepaticstellatecellsinvitro

YU Fu-xiang, SONG Cai-xin, WU Zhi-wei, ZHANG Qi-yu

(DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yfxbmu@163.com)

AIM: To investigate the effects of fat-specific protein 27 (Fsp27) on the proliferation and activation of hepatic stellate cells (HSCs)invitro.METHODSHSCs were isolated from the liver of SD rats. The mRNA and protein expression of Fsp27 in primary HSCs and activated HSCs was detected by real-time fluorescence quantitative PCR, immunofluorescence staining and Western blotting. After 72 h of transfection withFsp27-carrying lentivirus (pLV-Fsp27), the proliferation of HSCs was tested by CCK-8 assay, the protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSCs was detected by Western blotting, and the mRNA expression of fibrosis-related proteins, including matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) and transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), was determined by real-time fluorescence quantitative PCR.RESULTSRat HSCs were successfully isolated and cultured. The difference of Fsp27 expression between primary HSCs and activated HSCs was significant (P<0.01). The proliferation and activation of HSCs was inhibited 72 h after pLV-Fsp27 transfection (P<0.05). Fsp27 enhanced the mRNA expression of MMP-2 and down-regulate the mRNA expression of TIMP-1 and TGF-β1in activated HSCs (P<0.05).CONCLUSIONFsp27 inhibits the proliferation and activation of HSCs and regulates the expression of fibrosis-related proteins. Fsp27 may play an important role in maintenance of the quiescent phenotype of HSCs.

Fat-specific protein 27; Hepatic stellate cells; Activation

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1597- 06

2013- 03- 13

2013- 07- 02

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Y20120191)；浙江省重中之重外科學(xué)組資助(No.浙教高科2008-255)

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.010