銀杏達(dá)莫注射液抑制大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究*

王 靜, 姜玉新, 崔鳳娟, 閔志雪, 周萍萍, 王海華

(皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室, 安徽 蕪湖 241002)

銀杏達(dá)莫注射液抑制大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究*

王 靜, 姜玉新, 崔鳳娟, 閔志雪, 周萍萍, 王海華△

(皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室, 安徽 蕪湖 241002)

目的觀察銀杏達(dá)莫注射液預(yù)處理對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法SD雄性大鼠40只隨機(jī)分成5組(n=8)：正常對(duì)照(NC)組、缺血/再灌注(I/R)組、缺血預(yù)處理(IPC+I/R)組、銀杏達(dá)莫注射液預(yù)處理(GD+I/R)組和銀杏達(dá)莫+氯化鑭預(yù)處理(GD+LaCl3+I/R)組。觀察各組相同時(shí)點(diǎn)(預(yù)灌30 min穩(wěn)定點(diǎn)，缺血30 min，再灌5 min、30 min、60 min)的心功能指標(biāo),包括心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)和室內(nèi)壓變化速率(±dp/dtmax)，同時(shí)收集各時(shí)點(diǎn)冠脈流出液，檢測(cè)其中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)心肌線粒體Ca2+濃度和α-酮戊二酸脫氫酶(α-OGDH)含量。結(jié)果與I/R組比較，IPC+I/R組和GD+I/R組在心臟再灌注期各項(xiàng)心功能指標(biāo)均得到改善(P<0.05)；心肌LDH和CK的釋放量降低(P<0.01)；線粒體內(nèi)Ca2+超載降低(P<0.01)，且線粒體內(nèi)α-OGDH含量升高(P<0.05)；而GD+I/R組中銀杏達(dá)莫對(duì)心肌的保護(hù)作用被LaCl3抑制(P<0.05)。結(jié)論銀杏達(dá)莫可能通過抑制鈣超載、增強(qiáng)線粒體酶活性以穩(wěn)定線粒體能量代謝，從而緩解缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

銀杏達(dá)莫注射液； 氯化鑭； 缺血/再灌注損傷； 鈣超載； 線粒體

缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，也是我國(guó)死亡率最高的疾病之一，而缺血后的再灌注又會(huì)對(duì)心肌產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是I/R損傷發(fā)生的最重要機(jī)制之一。細(xì)胞內(nèi)Ca2+一直作為重要的第二信使發(fā)揮作用，但是鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到，Ca2+可以作為第一信使與細(xì)胞膜上的CaSR結(jié)合，引起胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+從而升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。大量研究證實(shí)CaSR參與了I/R損傷細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，并且通過1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)通路引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣耗竭通過線粒體-肌漿網(wǎng)膜引起線粒體內(nèi)鈣的變化從而誘發(fā)線粒體凋亡通路的活化[1-3]。銀杏達(dá)莫(ginkgo-dipyridamole, GD)是我國(guó)第4代銀杏葉提取物加入雙嘧達(dá)莫的復(fù)合制劑，因其具有保護(hù)血管內(nèi)皮，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和末梢血液循環(huán)障礙等功效而廣泛應(yīng)用于冠心病、血管栓塞、糖尿病等疾病的預(yù)防和治療；但目前尚未見到以GD作為預(yù)處理，研究其對(duì)I/R損傷心肌及線粒體的作用。本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff 離體心臟灌流技術(shù)，觀察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)離體心臟缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

SD雄性大鼠，體重(250±30)g，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(浙)20080033。

2主要試劑

乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-OGDH)和Ca2+試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；氯化鑭(lanthanum chloride,LaCl3)購(gòu)自Sigma; 銀杏達(dá)莫注射液為貴州益佰制藥公司生產(chǎn)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3主要設(shè)備

Langendorff離體心臟灌流裝置和Medlab/8C生物信號(hào)采集系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，紫外分光光度計(jì)(UV-3200PCS)，Model-680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

4主要方法

4.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共40只，隨機(jī)分5組(n=8)：(1)正常對(duì)照(normal control, NC)組，灌注全程均用富氧Krebs-Henseleit(K-H)液(118.4 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.1 mmol/L MgSO4，1.18 mmol/L KH2PO4，4.5 mmol/L NaHCO3，2.55 mmol/L CaCl2，11.1 mmol/L glucose，pH 7.4，充以95% O2和5% CO2的混合氣體)在恒溫(37 ℃)、恒壓(8.33 kPa)條件下灌注；(2)I/R組：富氧K-H液預(yù)灌30 min待心功能穩(wěn)定，全心缺血缺氧30 min，隨后用富氧K-H液復(fù)灌60 min；(3)缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning, IPC)+I/R組：富氧K-H液預(yù)灌30 min待心跳穩(wěn)定，行全心缺血缺氧5 min，富氧K-H液再灌5 min，重復(fù)3次，隨后的方法同I/R組；(4)GD+I/R組：富氧K-H液預(yù)灌30 min待心功能穩(wěn)定，用含銀杏達(dá)莫注射液(10 mg/L)的富氧K-H液預(yù)灌10 min，隨后的方法同I/R組；(5)GD+LaCl3+I/R組：富氧K-H液預(yù)灌30 min待心功能穩(wěn)定，用含LaCl3(10 μmol/L)的K-H液預(yù)灌10min，隨后的方法同GD+I/R組。

4.2實(shí)驗(yàn)方法 取健康大鼠，麻醉后迅速開胸取出心臟，置于0～4 ℃ K-H液中，主動(dòng)脈插管懸掛于Langendorff離體心臟灌流裝置上以富氧(充以95%O2+5%CO2)K-H液逆行灌注，在恒溫(37 ℃)、恒壓(8.33 kPa)條件下，調(diào)整灌脈流量為6～8 mL·min-1·g-1心肌。在左心耳剪一小口，用自制的乳膠小球囊放入左心室內(nèi)，通過Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄心功能指標(biāo)，使左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)維持在0～10 mmHg，用富氧K-H液預(yù)灌至離體心臟心跳恢復(fù)和心功能指標(biāo)穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。記錄各組預(yù)灌30 min穩(wěn)定點(diǎn)，缺血30 min，再灌5 min、30 min和60 min的心功能指標(biāo)[左室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、心率(heart rate, HR)和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure, ±dp/dtmax)]，同時(shí)收集各時(shí)點(diǎn)的冠脈灌流液，用比色法測(cè)定其LDH和CK活性，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

4.3線粒體勻漿制備 參照Spector等[4]的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取心臟0.2 g，加9倍于心臟重量的預(yù)冷勻漿溶液進(jìn)行勻漿；4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取上清，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，沉淀物即為線粒體。將線粒體用20倍的預(yù)冷勻漿溶液制備成混懸液，用比色法測(cè)定Ca2+濃度，ELISA法檢測(cè)線粒體α-OGDH含量，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來(lái)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1銀杏達(dá)莫對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷心功能的作用

從表1組內(nèi)結(jié)果看，I/R組在再灌5 min心功能恢復(fù)，但再灌30 min時(shí)心臟做功量(LVSP×HR)降低(與再灌5 min比較，P<0.05)，再灌60 min時(shí)做功量明顯降低(與再灌5 min比較，P<0.01)，說明出現(xiàn)了再灌注損傷。IPC+I/R組和GD+I/R組再灌30 min和60 min的做功量與再灌5 min相比均沒有出現(xiàn)明顯的降低；GD+LaCl3+I/R組再灌30 min做功量與再灌5 min相比沒有降低，但再灌60 min后做功量出現(xiàn)下降(與再灌5 min比較，P<0.05)。結(jié)果提示：I/R組再灌注過程中出現(xiàn)了心功能損傷；GD與IPC均緩解了缺血/再灌注心功能損傷，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞鈣超載，穩(wěn)定線粒體能量代謝有關(guān)；加入LaCl3后，對(duì)心臟的保護(hù)作用有所降低。

表1顯示各組間心臟的做功量(LVSP×HR)在心臟穩(wěn)定點(diǎn)均未見明顯差異；缺血30 min后，與NC組相比，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組心臟做功量均明顯降低(P<0.01)。與I/R組相比，再灌5 min時(shí)，IPC+I/R組和GD+I/R組做功量已開始恢復(fù)(P<0.05)，再灌30 min和60 min時(shí)均已明顯恢復(fù)(P<0.01)；但GD+LaCl3+I/R組做功量的恢復(fù)在再灌5 min時(shí)未見改善，而到再灌30 min至60 min時(shí)均出現(xiàn)改善(P<0.05)。加入10 μmol/L 的LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的做功量與GD+I/R組相比在再灌60 min差異顯著(P<0.05)。結(jié)果提示：GD與IPC類似，在再灌初期(5 min)即可使心肌損傷得到改善，加入LaCl3后，對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)被推遲，至再灌30 min才出現(xiàn)明顯結(jié)果，其機(jī)制可能與LaCl3增加了細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。

±dp/dtmax的結(jié)果顯示，I/R組再灌5 min時(shí)±dp/dtmax恢復(fù)，但再灌30 min時(shí)±dp/dtmax降低(與再灌5 min比較，P<0.05)，再灌60 min時(shí)±dp/dtmax明顯降低(與再灌5 min比較，P<0.01)，說明再灌注引起心肌細(xì)胞收縮能力的減弱。各組間在心臟穩(wěn)定點(diǎn)無(wú)顯著差異(P>0.05)，缺血缺氧30 min后，與NC組相比，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax均明顯下降(P<0.01)。與I/R組相比，再灌5 min和30 min后，IPC+I/R組和GD+I/R組的+dp/dtmax已開始恢復(fù)(P<0.05)，再灌至60 min時(shí)已明顯恢復(fù)(P<0.01)；但加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax直至再灌60 min時(shí)才開始恢復(fù)(P<0.05)。而與GD+I/R組相比，GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax在再灌30 min和60 min均差異明顯(P<0.05)。再灌過程中，各組心肌的-dp/dtmax的變化與+dp/dtmax的變化略有不同，如再灌5 min時(shí)，IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的-dp/dtmax恢復(fù)程度與I/R組相比無(wú)明顯區(qū)別，而再灌30 min及60 min時(shí)出現(xiàn)差異(P<0.05)。結(jié)果提示：GD和 IPC能改善I/R過程心肌收縮能力及心肌順應(yīng)性，加入LaCl3后，心肌收縮能力和順應(yīng)性的恢復(fù)有所降低。

表1 銀杏達(dá)莫對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷心功能的作用

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point；&P<0.05vsGD+I/R group at the same point；△P<0.05，△△P<0.01vsreperfusion 5 min in the same group.

2冠脈流出液中LDH和CK活性的變化

表2顯示，經(jīng)過全心缺血缺氧30 min后，各組冠脈流出液中LDH和CK活性都隨時(shí)間推移逐漸升高，特別是I/R組再灌30 min與再灌5 min已出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，至再灌60 min已達(dá)顯著差異(P<0.01)。與NC組相比，缺血30 min時(shí)，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組LDH和CK活性均升高(P<0.05)。與I/R組相比，再灌5 min， IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的LDH和CK活性無(wú)顯著差異(P>0.05)；再灌30 min，IPC+I/R組和GD+I/R組的LDH和CK活性降低(P<0.05)，且再灌60 min時(shí)其活性明顯降低(P<0.01)；GD+LaCl3+I/R組的LDH和CK活性到再灌60 min出現(xiàn)差異(P<0.05)，見圖1。結(jié)果提示,再灌過程各組心肌均出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)酶(LDH和CK)的外漏，GD和IPC抑制了再灌注過程中心肌細(xì)胞內(nèi)酶的外漏，但其效果在再灌初期并不明顯，到再灌30 min才出現(xiàn)明顯結(jié)果；加入LaCl3抑制酶外漏的效果減弱，到再灌60 min才出現(xiàn)明顯效果。

表2 冠脈流出液中LDH和CK活性的變化

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point.

3線粒體Ca2+濃度的組間變化

與NC組相比，I/R組心肌線粒體內(nèi)明顯出現(xiàn)鈣超載(P<0.01)；與I/R組相比，IPC+I/R組和GD+I/R組鈣超載現(xiàn)象明顯得到緩解(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R組鈣超載現(xiàn)象也得到緩解(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的Ca2+濃度比GD+I/R組高(P<0.05),見圖1。結(jié)果提示：GD和IPC能抑制缺血/再灌注造成的線粒體鈣超載，其機(jī)制可能是抑制了細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流或者調(diào)節(jié)線粒體儲(chǔ)Ca2+能力；而且GD抑制鈣超載的作用在加入LaCl3后被減弱。

4線粒體α-OGDH含量的組間變化

NC組的α-OGDH含量處于較高水平，I/R組線粒體α-OGDH含量明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，IPC+I/R組和GD+I/R組α-OGDH含量明顯恢復(fù)(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R組α-OGDH含量也有恢復(fù)(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的α-OGDH含量比GD+I/R組有所降低(P<0.05)，見圖2。結(jié)果提示,GD和IPC能增加再灌注損傷后線粒體內(nèi)能量代謝關(guān)鍵酶含量，其機(jī)制可能與穩(wěn)定線粒體內(nèi)Ca2+水平有關(guān)。

Figure 1. Changes of Ca2+concentration in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

圖1線粒體Ca2+濃度的變化

Figure 2. Changes of the content of α-OGDH in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

圖2線粒體α-OGDH含量的變化

討 論

心肌I/R損傷在各類心臟手術(shù)(如心臟移植、心跳驟停復(fù)蘇及冠脈溶栓術(shù)等)中都有發(fā)生，但I(xiàn)/R損傷的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。已有證據(jù)表明，再灌注啟動(dòng)的最初數(shù)分鐘內(nèi)即可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體能量合成障礙、氧自由基生成等現(xiàn)象[5]。通過缺血前的多次短暫的缺血-再灌措施即缺血預(yù)處理可通過降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載、改善內(nèi)皮功能、減少中性粒細(xì)胞聚集等機(jī)理而有效地保護(hù)心肌[6-8]。CaSR屬于G蛋白偶聯(lián)受體C家族成員，主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+和其它金屬離子的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞外的Ca2+、其它多價(jià)陽(yáng)離子(Gd3+、Mg2+、La3+等)、多胺、L-氨基酸等均可激活CaSR，CaSR激活后可以通過IP3通路引起肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，進(jìn)而損傷線粒體并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。CaSR在心肌I/R損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過激活MAPKs-CytC-caspase-3通路和Fas受體死亡通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[9-11]。

心臟正常收縮和舒張功能對(duì)維持正常的血流動(dòng)力有重要的意義。LVSP和+dp/dtmax可反映心肌最大收縮能力，-dp/dtmax反映心肌的最大舒張力，是衡量心肌舒張順應(yīng)性的指標(biāo)，HR從整體反映心臟的工作性能。心肌缺血/再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌舒縮功能的降低，表現(xiàn)為持久的心輸出量減少以及±dp/dtmax降低等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏達(dá)莫使再灌注期的LVSP和±dp/dtmax均明顯升高，說明銀杏達(dá)莫能使I/R損傷時(shí)心肌收縮能力增強(qiáng)，改善心肌順應(yīng)性。缺血/再灌注損傷時(shí)，線粒體能量代謝障礙與鈣超載和氧自由基的產(chǎn)生互為因果，共同加劇了細(xì)胞的不可逆損傷，如細(xì)胞損傷和死亡、細(xì)胞內(nèi)酶外漏(如LDH和CK)等[13-16]，而α-OGDH對(duì)線粒體的能量代謝和活性氧生成起著重要作用[17-18]。在I/R損傷時(shí)，由于細(xì)胞缺氧導(dǎo)致α-OGDH的含量降低[19]。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏達(dá)莫可降低I/R損傷期間LDH和CK的外漏，同時(shí)提高了α-OGDH的含量，以緩解I/R所誘導(dǎo)的心肌損傷。銀杏達(dá)莫對(duì)I/R損傷心肌的保護(hù)作用可以被CaSR激動(dòng)劑LaCl3抑制，因此我們推測(cè)銀杏達(dá)莫對(duì)I/R損傷心肌的保護(hù)可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)Ca2+水平來(lái)穩(wěn)定線粒體能量代謝從而延緩細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證實(shí)銀杏達(dá)莫可以通過抑制鈣超載、增強(qiáng)線粒體酶活性以穩(wěn)定線粒體能量代謝，從而緩解缺血/再灌注對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，而這種保護(hù)效應(yīng)是否是銀杏達(dá)莫作為鈣通道阻斷劑而發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。

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Inhibitoryeffectofginkgo-dipyridamoleinjectiononischemia/reperfusioninjuryinratheartsinvitro

WANG Jing, JIANG Yu-xin, CUI Feng-juan, MIN Zhi-xue, ZHOU Ping-ping, WANG Hai-hua

(DepartmentofPhysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:wanghaihua9972@sina.com)

AIM: To investigate the effect of ginkgo-dipyridamole injection (GD) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat heartsinvitroand its possible mechanism.METHODSForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups (n=8): normal control (NC) group, I/R group, ischemic preconditioning (IPC)+I/R group, GD+I/R group and GD+LaCl3+I/R group. Cardiac function indexes, including heart rate (HR), left ventricular systolic pressure (LVSP) and the maximal rise/fall rate of left ventricular pressure (±dp/dtmax), were detected at 5 time points, including stabilizing point, 30 min after ischemia, and 5, 30 and 60 min after reperfusion. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) in coronary effluent at the five time points was assayed. The concentration of Ca2+and the content of α-ketoglutarate dehydrogenase (α-OGDH) in myocardial mitochondria were determined at the end of the whole experiment.RESULTSCompared with I/R group, the cardiac function indexes in IPC+I/R and GD+I/R groups were improved at the reperfusion period (P<0.05), the activity of LDH and CK in coronary effluent and the concentration of Ca2+in mitochondria were significant reduced (P<0.01), and the content of α-OGDH was increased (P<0.05). However, the protective effect of GD was inhibited by LaCl3(P<0.05).CONCLUSIONGD protects rat hearts against I/R injury by inhibiting calcium overload and improving mitochondrial enzyme activity to stabilize mitochondrial energy metabolism.

Ginkgo-dipyridamole injection; Lanthanum chloride; Ischemia/reperfusion injury; Calcium overload; Mitochondria

中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)2013年活動(dòng)計(jì)劃表

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1573- 06

2013- 04- 15

2013- 06- 28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81172790);安徽省自然科學(xué)研究重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.KJ2013A251);皖南醫(yī)學(xué)院中青年基金資助項(xiàng)目(No.WK201310);皖南醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研基金資助項(xiàng)目(No.WK2012Z01)

△通訊作者 Tel： 0553-3866058; E-mail: wanghaihua9972@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.006