基于DPPH法對(duì)紫莖澤蘭提取物抗氧化活性的研究

胡楚嬌， 王崇云， 和兆榮， 朱 薇， 黃羅冬

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650091)

基于DPPH法對(duì)紫莖澤蘭提取物抗氧化活性的研究

胡楚嬌， 王崇云， 和兆榮， 朱 薇， 黃羅冬

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650091)

以維生素C為對(duì)照，采用DPPH法研究紫莖澤蘭葉和莖醇提物的抗氧化活性，并計(jì)算它們的IC50。結(jié)果表明：1.6 mg/mL紫莖澤蘭葉和莖的醇提物有很好的清除能力，清除率均達(dá)到80%以上，相當(dāng)于0.10 mg/mL維生素C的清除率；紫莖澤蘭葉和莖的IC50為0.3、0.7 mg/mL，維生素C為0.04 mg/mL。說明紫莖澤蘭葉的清除能力強(qiáng)于莖，紫莖澤蘭清除自由基的能力為維生素C的1/10?？傊?，紫莖澤蘭具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

紫莖澤蘭；提取物；抗氧化活性；維生素C

紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)別稱破壞草、敗馬草、解放草、飛機(jī)草、黑頭草、大毒草、革命草、飛花草等，屬菊科(Compositae)假藿香薊屬(AgeratinaL.)多年生草本或亞灌木，也有人將它歸入澤蘭屬(EupatoriumL. )。紫莖澤蘭原產(chǎn)于中美洲墨西哥至哥斯達(dá)黎加一帶[1]，大約在1865年作為觀賞植物被引入美國(guó)、澳大利亞，隨后在新西蘭、南非、印度、菲律賓、馬來西亞、新加坡、印度、泰國(guó)和緬甸等地迅速蔓延[2-3]。在1940年左右從緬甸邊境入侵我國(guó)云南，之后迅速向西南傳播擴(kuò)散。紫莖澤蘭的種子很小，且在頂端具有冠狀毛，可借冠毛隨風(fēng)傳播，此外還可依靠帶根的莖快速擴(kuò)展蔓延，進(jìn)行無性繁殖[4]。紫莖澤蘭有很強(qiáng)的適應(yīng)能力和抗逆能力，無論在干旱、瘠薄的荒坡隙地，還是在石縫和樓頂都能存活生長(zhǎng)，已廣泛分布于熱帶、亞熱帶的30 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[5]。有研究表明，入侵我國(guó)的紫莖澤蘭種群具有豐富的遺傳多樣性，并能產(chǎn)生一定程度的適應(yīng)性進(jìn)化，已在形態(tài)結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)一些適應(yīng)性的性狀[6]。目前，紫莖澤蘭已在云南、四川、重慶、貴州、廣西等地區(qū)蔓延成災(zāi)[7-8]，而且正以約 60 km/年的速度向北擴(kuò)張，還有向長(zhǎng)江以南大部分地區(qū)和西部大部分地區(qū)入侵的可能性[9]，是我國(guó)危害最嚴(yán)重的外來入侵物種之一，已被我國(guó)有關(guān)部門列為首批入侵國(guó)內(nèi)16種外來物種之首[10]。

天然藥物對(duì)人體疾病具有顯著的預(yù)防和治療作用，主要?dú)w因于其含有能清除人體過量自由基的抗氧化成分，抗氧化成分可歸納為黃酮類、苯酚類、皂苷類、鞣質(zhì)類、生物堿類和其他類等六大類[11]。從紫莖澤蘭中分離出100多種化學(xué)成分，這些化學(xué)成分種類有單萜類、倍半萜類、三萜類、甾體類、黃酮類、苯丙素類及各類衍生物[12]，其化學(xué)成分的生物活性主要表現(xiàn)為殺蟲、抑菌和對(duì)其他植物的化感作用等[13-17]，但對(duì)其抗氧化活性和抗氧化成分的研究還未見報(bào)道。所以，本研究利用70%乙醇提取紫莖澤蘭葉和莖的有效成分，通過DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基)自由基清除能力初步分析紫莖澤蘭的抗氧化能力，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用紫莖澤蘭提供理論依據(jù)，從而更好地防治紫莖澤蘭，為這一世界性惡性雜草的利用開辟途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自云南大學(xué)校園，采樣時(shí)間為2012年11月，憑證標(biāo)本保存于云南大學(xué)植物標(biāo)本館。取新鮮的紫莖澤蘭洗凈陰干，將莖和葉分開，粉碎過40目篩，分別得到葉和莖的粉末，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-BA95型循環(huán)水式多用真空泵，7520型分光光度計(jì)，Spectrumlab 53 型紫外可見分光光度計(jì)，DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱，恒溫水浴鍋。無水乙醇，70%乙醇，DPPH自由基，維生素C。

1.3 提取物的制備

分別稱取紫莖澤蘭葉和莖粉末5 g，按固液比 1 g ∶10 mL 加入70%乙醇，冷浸24 h，超聲2次，每次 20 min，70～85 ℃下回流提取2次，每次1 h，合并溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收溶劑，制得浸膏，再溶解定容至 50 mL，得原液濃度為100 mg/mL的紫莖澤蘭葉和莖醇提物備用。精確稱取0.1 g 維生素C，用無水乙醇溶解至100 mL，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH 法是20世紀(jì)50年代提出的，最初用于發(fā)現(xiàn)食物中的供氫體，后來被廣泛用于定量評(píng)價(jià)生物制品、酚類和食品的抗氧化能力[18]。DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種性質(zhì)很穩(wěn)定的自由基，醇溶液為紫色，具有單一的未配對(duì)電子，能接受1個(gè)電子，在517 nm 處有最大的穩(wěn)定的吸光度。當(dāng)有自由基清除物質(zhì)存在時(shí)，會(huì)結(jié)合抗氧化劑而得到電子，使其顏色變淺。在紫外光照射下表現(xiàn)為最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度下降，且下降程度呈線性關(guān)系，從而可以利用這一性質(zhì)來判斷提取物的抗氧化能力[19]。

1.4.1 DPPH·溶液配制 精確稱取0.020 2 g DPPH·，加入無水乙醇溶解，定容到100 mL，搖勻，作為儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＞_吸取上述儲(chǔ)備液10 mL，定容到100 mL，得濃度為 0.020 2 mg/mL的工作液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 清除DPPH·活性的測(cè)定 在試管中加入 2 mL DPPH·溶液和2 mL無水乙醇，混勻，反應(yīng) 30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)作D0；取紫莖澤蘭葉(莖)提取液1 mL，稀釋50倍，得2 mg/mL提取液，分別吸取1、2、3、4、5、6、7、8 mL于試管中，定容至10 mL。在試管中加入2 mL DPPH·溶液和2 mL提取液，混勻，反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，記作Di；取2 mL提取液和2 mL無水乙醇，混勻，反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)為Dj；按照公式計(jì)算清除率：清除率 = 1-(Di-Dj)/D0×100%，以此評(píng)價(jià)自由基清除能力，以提取液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制清除曲線。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，將維生素C溶液配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 mg/mL等8種不同的濃度，按照上述方法測(cè)定其517 nm的吸光度并計(jì)算清除率。以維生素C質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)3次，求抑制率的平均值。

當(dāng)抗氧化劑濃度較高時(shí)，其濃度與DPPH·清除率不能形成線性關(guān)系。因此，清除率往往不能很好地表示自由基的清除能力，也不便于對(duì)抗氧化能力進(jìn)行比較。一般在評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化性能和自由基清除能力時(shí)，常選擇計(jì)算清除率為50%時(shí)抗氧化劑對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(半抑制濃度，IC50)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[20-21]。IC50越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強(qiáng)；IC50越高，清除活性越弱。根據(jù)清除率與質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系，計(jì)算出紫莖澤蘭葉和莖以及維生素C的IC50，通過比較IC50判斷紫莖澤蘭DPPH自由基的清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C對(duì)DPPH·的清除作用

由圖1可以看出，維生素C對(duì)DPPH·的清除率非常高，回歸方程為y=5.142 9x+0.28(r2=0.995 8)，隨著維生素C濃度的增加，清除率不斷變大，當(dāng)維生素C濃度為0.14 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為99%。

2.2 紫莖澤蘭對(duì)DPPH·的清除作用

由圖2可知，紫莖澤蘭葉和莖的醇提液濃度與DPPH·的清除率基本呈線性關(guān)系，DPPH·的清除能力隨著醇提液濃度的增加而增強(qiáng)。在相同濃度下，紫莖澤蘭葉的清除能力明顯高于莖的清除能力。當(dāng)醇提液濃度為1.6 mg/mL時(shí)，紫莖澤蘭葉和莖的清除率最高分別為87%、80%，均有很好的清除能力，分別相當(dāng)于0.12、0.10 mg/mL 維生素C的清除能力。

2.3 紫莖澤蘭抗氧化活性IC50的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，莖澤蘭葉、莖和維生素C的IC50分別為0.30、0.70、0.04 mg/mL，紫莖澤蘭葉的清除能力強(qiáng)于莖，約為維生素C的1/10。

3 結(jié)論與討論

作為我國(guó)危害最嚴(yán)重的外來入侵物種之一，紫莖澤蘭具有異株克生現(xiàn)象和驚人的繁殖能力，排斥其他植物的生長(zhǎng)，逐漸形成密集成片的單種優(yōu)勢(shì)群落，導(dǎo)致原有的植物群落衰退和消失[5，11]。極強(qiáng)的繁殖力、適應(yīng)力和生命力使紫莖澤蘭分布廣泛，不斷蔓延成災(zāi)，很容易就能獲得大量的材料。因此，開展紫莖澤蘭的活性研究、挖掘其利用價(jià)值，不僅可以減少危害，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，還能帶來較高的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益，從而使之變害為寶。在本試驗(yàn)條件下，紫莖澤蘭葉和莖均有很好的DPPH·清除能力。在相同濃度下，葉的清除能力明顯強(qiáng)于莖，說明紫莖澤蘭抗氧化活性物質(zhì)多集中在葉中。

抗氧化物質(zhì)是指能夠清除氧自由基，抑制、消除或減緩氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)。有關(guān)抗氧化物質(zhì)的來源，目前許多報(bào)道認(rèn)為幾乎所有植物都具有抗氧化功能，研究較多的是中草藥類、香料類、蔬菜類、水果類、植物飲品和谷物類[20]，對(duì)分布廣泛且廉價(jià)的雜草資源研究較少，因此，對(duì)紫莖澤蘭這一惡性雜草進(jìn)行抗氧化研究，并從中分離純化具有高抗氧化活性的物質(zhì)，具有廣泛的原料來源和廣闊的運(yùn)用前景。

本研究首次對(duì)紫莖澤蘭抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明紫莖澤蘭具有顯著的抗氧化能力，為紫莖澤蘭抗氧化活性的研究打下了基礎(chǔ)，也為開發(fā)利用紫莖澤蘭資源，為其變害為寶指明了新方向，同時(shí)為紫莖澤蘭的控制和進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，在紫莖澤蘭控制、化學(xué)成分研究和抗氧化物質(zhì)的開發(fā)等方面具有重要意義。但其抗氧化的主要活性物質(zhì)和在體內(nèi)抗氧化活性，仍需要進(jìn)一步研究。下一步工作將考慮對(duì)紫莖澤蘭抗氧化活性成分進(jìn)行分離純化，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定，弄清具有抗氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，并開展紫莖澤蘭體內(nèi)抗氧化能力的研究，提出開發(fā)利用的參考，最終為紫莖澤蘭這一世界性惡性雜草的利用開辟途徑。

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StudyonAntioxidantActivityofExtractsfromAgeratinaadenophorabasedonDPPHMethod

HU Chu-jiao，WANG Chong-yun，HE Zhao-rong，ZHU Wei，HUANG Luo-dong

(School of Life Science，Yunnan University，Kunming650091，China)

With vitamin C as a reference，the antioxidant activity of ethanol extracts from the leaves and stems ofAgeratinaadenophora(Spreng.) R. M. King & H. Rob. were studied by the DPPH method and their IC50values were calculated. Extracts of both leaves and stems were good scavengers. At 1.6 mg/mL，extracts exhibited the best scavenging activity at above 80%. Their capacities equaled 0.10 mg/mL vitamin C. While the IC50values of leaves and stems were 0.3 and 0.7 mg/mL，that of vitamin C was 0.04 mg/mL. This indicated that the scavenging capacities of leaf extracts were better than stem extracts，and that the scavenging capacities ofA.adenophoraextracts was about 1/10 of vitamin C. ThusA.adenophorahad stronger antioxidant activity than vitamin C.

AgeratinaadenophoraSpreng.；extracts；antioxidant；vitamin C

Q946

A

1003-935X(2013)04-0009-04

胡楚嬌，王崇云，和兆榮，等. 基于DPPH法對(duì)紫莖澤蘭提取物抗氧化活性的研究[J]. 雜草科學(xué)，2013，31(4)：9-12.

2013-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31160080、31260078)。

胡楚嬌(1989—)，女，云南昭通人，碩士研究生，主要從事植物分類和植物化學(xué)成分研究。E-mail：371129989@qq.com。

和兆榮，副教授，博士，主要從事植物系統(tǒng)分類研究。E-mail：zhrhe@ynu.edu.cn。