血府逐瘀膠囊預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后病理學(xué)改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

楊仲紅，任峻青，陳 勇

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，河北 張家口 075000）

血府逐瘀膠囊源自清代 《醫(yī)林改錯》，組方含有炒桃仁、枳殼、當(dāng)歸、川芎、紅花、牛膝、柴胡、地黃、赤芍、甘草、桔梗等，有活血化瘀、行氣通絡(luò)之功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，血府逐瘀膠囊中單藥具有降低血液黏度、擴(kuò)張血管、改善腦血流、改善微循環(huán)、抑制炎性反應(yīng)等作用［1］。臨床上常用來治療缺血性腦血管病，療效可靠，副作用小，但是，其作用機(jī)制尚未完全明了。本研究通過觀察血府逐瘀膠囊預(yù)處理對SD大鼠腦缺血再灌注后組織病理學(xué)改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討其對腦缺血再灌注保護(hù)作用的可能的作用機(jī)制，以期進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康SPF／UAF級SD （sprague-dawley）大鼠138只 ［許可證號：SCXK （京）2006-0008］，雄性，體質(zhì)量250～290g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部。飼養(yǎng)于20～22℃室溫環(huán)境中，自由飲食進(jìn)水。實驗時，稱重后隨機(jī)將大鼠分成6組：正常組、假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參片組、血府逐瘀膠囊A組、血府逐瘀膠囊B組，每組23只。各實驗組均大腦中動脈栓塞缺血2h后，分別再灌注12h、24h、72h，假手術(shù)組除外。

1.2 藥物與試劑

血府逐瘀膠囊：北京同仁堂有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字Z12020223，批號H200903020，規(guī)格0.4g×24粒）。復(fù)方丹參片：廣州白云山制藥廠生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字Z44023372，產(chǎn)品批號：C7A013，規(guī)格0.25g×60片）。凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。栓線［線長40mm，頭端直徑（0.32±0.02）mm，線身直徑0.24mm］購自北京沙東生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號2432-100。

根據(jù)人與大鼠體表面積等效劑量折算表計算后，按相應(yīng)劑量分別給予各組大鼠血府逐瘀膠囊、復(fù)方丹參片，采用口服給藥，連續(xù)21d，每日1次。給藥劑量分別為：血府逐瘀膠囊A組504mg·kg－1·d－1，B組1 008mg·kg－1·d－1，復(fù)方丹參片組236.25mg·kg－1·d－1。假手術(shù)組和模型組動物給予等量自來水口服。給藥d 21，給藥1h后行大腦中動脈栓塞，腦缺血再灌注手術(shù)。待各組大鼠術(shù)后清醒，進(jìn)行Longa評分并觀察活動度變化。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備

大鼠左側(cè)大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型的制備參考Longa E Z等人文獻(xiàn)采用改進(jìn)Longa線栓法制備［2］。SD大鼠術(shù)前禁食24h，自由飲水，7%水合氯醛腹腔注射麻醉，350mg·kg－1。缺血時間2h。待動物清醒后，進(jìn)行神經(jīng)功能評分 （采用Longa評分標(biāo)準(zhǔn)，0分：無神經(jīng)功能缺損體征；1分：不能充分伸展對側(cè)前爪；2分：行走時向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾斜；4分：不能行走，意識喪失），1～3分者納入實驗，不符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn)的動物剔除。假手術(shù)組只進(jìn)行頸部切口，暴露頸外動脈，不插線，其余步驟與其他實驗組保持一致。

1.4 動物灌注固定與取材

待各組大鼠缺血再灌注至所需時間點時，麻醉狀態(tài)下，仰臥位固定大鼠，暴露心臟，從心臟常規(guī)灌注150mL 4%多聚甲醛固定，30min后迅速斷頭取腦，將腦組織從前向后等分成五等份，每份厚度約2～3mm，依次標(biāo)記為A、B、C、D、E腦片，選取C腦片，4%多聚甲醛固定24h后備用。

1.5 TTC染色及腦梗死面積測定

缺血再灌注后，各組隨機(jī)抽取5只大鼠，迅速斷頭取腦，切除嗅腦、小腦和低位腦干，將腦組織從前向后等分成厚度約2～3mm厚的五等份，選取中間腦片迅速置于2%TTC溶液中避光染色30min。4%多聚甲醛固定24h。染色結(jié)果，正常腦組織呈紅色，缺血區(qū)呈灰白色，界線清晰。經(jīng)計算機(jī)圖像分析測量，計算腦梗死面積 （健側(cè)腦片面積減去缺血側(cè)TTC染色正常區(qū)面積）。

1.6 HE染色和TUNEL凋亡測定

制備常規(guī)石蠟切片，4℃儲存?zhèn)溆?。行HE染色觀察病理形態(tài)，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，經(jīng)DAB顯色后常規(guī)脫水、透明、封片，鏡下觀察分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評分及腦梗死體積

實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注后，腦梗死體積百分比隨再灌注時間的延長逐漸增大，至缺血再灌注24h時，復(fù)方丹參片組為 （39.23±0.38）%，血府逐瘀膠囊A組為 （37.12±0.37）%，血府逐瘀膠囊B組則為 （36.12±0.37）%。血府逐瘀膠囊 A、B組與模型組梗死面積 （41.01±0.38）%相比，明顯減?。≒＜0.05）。

表1 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響 （±s）

表1 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響 （±s）

注：n為SD大鼠只數(shù)。與正常組比較，△P＞0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05；與復(fù)方丹參片組比較，＃P＜0.05。

組別再灌注后神經(jīng)功能行為學(xué)評分2h（n＝23） 24h（n＝23） 48h（n＝18）正常組 0±0 0±0 0±0＃假手術(shù)組 0±0△ 0±0△ 0±0△模型組 2.2±0.8△△ 2.8±0.4△△ 2.9±0.3△△復(fù)方丹參片組 2.0±0.6 2.5±0.5 2.4±0.5血府逐瘀膠囊A組 1.3±0.5＊ 1.7±0.5＊＃ 1.2±0.4＊＃血府逐瘀膠囊B組 1.2±0.4＊＃ 1.5±0.8＊＃ 1.2±0.4＊

2.2 病理組織學(xué)改變

光鏡 （×400）下觀察，模型組大鼠腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、排列狀態(tài)、組織間隙水腫程度均隨缺血時間的延長呈進(jìn)行性變化。病灶中心區(qū)甚至出現(xiàn)大量液化性壞死、囊性變、網(wǎng)狀變。缺血半暗帶明顯，缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞體積明顯縮小，膠質(zhì)細(xì)胞固縮。

血府逐瘀膠囊預(yù)處理組及復(fù)方丹參片組與模型組相比，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管的缺血性病理形態(tài)學(xué)改變程度較輕，胞體完整，突起較清楚，基本保持完整；組織間隙水腫較輕，炎性反應(yīng)較輕。表明血府逐瘀膠囊預(yù)處理可不同程度的減緩腦缺血再灌注損傷時的腦組織病理改變。

2.3 凋亡細(xì)胞的觀察

光鏡下 （×400）觀察，胞核中可見棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，陰性細(xì)胞胞核呈藍(lán)色。每張切片隨機(jī)在梗死灶中心和周邊區(qū)各選擇10個不同視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，缺血對側(cè)半球腦組織切片陽性細(xì)胞罕見，模型組缺血半球可見大量凋亡細(xì)胞，分布廣泛，在缺血中心區(qū)和病灶周邊區(qū)均可見。血府逐瘀膠囊預(yù)處理各組缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞亦分布于整個缺血中心區(qū)，病灶邊緣也可見少量凋亡細(xì)胞。血府逐瘀膠囊藥物治療組缺血側(cè)腦組織陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于模型組陽性細(xì)胞數(shù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），各組凋亡細(xì)胞數(shù)目結(jié)果見表2、表3。

表2 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊凋亡細(xì)胞值的影響 （±s）

表2 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊凋亡細(xì)胞值的影響 （±s）

注：與正常組比較，△P＞0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05；與復(fù)方丹參片組比較，＃P＜0.01。

組別 n 梗死灶周邊神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目 （個／400倍視野）12h 24h 72h正常組6 1.2±1.0 1.3±1.0 1.0±1.1假手術(shù)組 6 1.2±1.0△ 1.0±1.0△ 1.0±0.6△模型組 6 37.3±2.7△△ 55.2±6.6△△ 7.2±2.1△△復(fù)方丹參片組 6 28.2±2.7＊ 46.8±8.6＊ 6.3±2.7血府逐瘀膠囊A組 6 17.0±3.6＊＃ 28.2±5.9＊＃ 6.0±1.7血府逐瘀膠囊B組 6 16.2±3.6＊＃ 28.0±6.1＊＃6.2±1.9

表3 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠梗死灶中心凋亡細(xì)胞值的影響 （±s）

表3 血府逐瘀膠囊預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠梗死灶中心凋亡細(xì)胞值的影響 （±s）

注：與正常組比較，△P＞0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＞0.05；與模型組比較，＊P＜0.01；與復(fù)方丹參片組比較，＃P＜0.05

組別 n 梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目 （個／400倍視野）12h 24h 72h正常組6 1.0±0.6 0.8±1.2 1.0±0.6假手術(shù)組 6 1.2±0.9△ 1.7±1.4△ 0.8±0.8△模型組 6 1.2±0.8△△ 1.0±0.6△△ 1.3±1.0△△復(fù)方丹參片組 6 4.3±1.2＊ 15.3±2.1＊ 7.2±0.9＊血府逐瘀膠囊A組 6 6.2±1.7＊＃ 19.5±3.0＊＃ 6.7±1.4＊血府逐瘀膠囊B組 6 7.2±1.5＊＃ 16.2±2.3＊ 6.8±1.6＊

3 討 論

局灶性腦缺血模型 （MCAO模型）是最常用的腦缺血實驗動物模型，大腦中動脈是臨床缺血性腦血管意外的多發(fā)部位，所以MCAO廣泛應(yīng)用于腦缺血相關(guān)性疾病的研究［3］。MCAO模型適用于對神經(jīng)元缺血敏感性、耐受性、再灌注損傷以及治療最佳時間的研究，是研究缺血性腦損傷及其保護(hù)作用相關(guān)性研究的工具［4］。神經(jīng)細(xì)胞死亡有壞死和凋亡兩種方式，涉及主動和被動細(xì)胞死亡機(jī)制［5］。細(xì)胞凋亡發(fā)生最顯著的部位是缺血半暗帶，神經(jīng)元凋亡在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中扮演著重要的角色。腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制與很多因素有關(guān)，比如鈣超載、興奮性氨基酸、氧化自由基增多等，其中較為重要和直接的因素是凋亡細(xì)胞內(nèi)活躍的基因表達(dá)。缺血時間對梗死灶中心及缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的影響程度不同，梗死灶中心區(qū)通常以細(xì)胞壞死為主；缺血半暗帶位于梗死灶周圍的低灌注區(qū)，如果缺血時間短，血流供應(yīng)能及時恢復(fù)，部分細(xì)胞可能恢復(fù)正常生理功能；若低灌注持續(xù)時間較長，由于血氧及能量供應(yīng)缺乏，則細(xì)胞發(fā)生凋亡，使梗死范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。TUNEL法又稱DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法，此方法可以對凋亡細(xì)胞核中DNA分子斷裂缺口中的3′-OH進(jìn)行原位標(biāo)記，借助熒光顯微鏡觀察，從而判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。是目前比較常用也是特異性較強(qiáng)的檢測細(xì)胞凋亡的方法。

本研究結(jié)果顯示，血府逐瘀膠囊各組與模型組比較，凋亡率差異有顯著性。血府逐瘀膠囊由紅花、桃仁、當(dāng)歸等組成，全方具有調(diào)氣活血作用。血府逐瘀膠囊預(yù)處理各組腦梗死灶中心部位的部分神經(jīng)細(xì)胞主要死亡方式為凋亡，而不是壞死，推測可能與該藥物具有減輕炎癥級聯(lián)反應(yīng)的作用有關(guān)。血府逐瘀膠囊預(yù)處理對梗死灶周圍細(xì)胞凋亡也有顯著抑制作用，可縮小梗死面積，梗死灶中心及缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸與病灶及其周圍神經(jīng)細(xì)胞重塑關(guān)系密切。上述保護(hù)作用可能促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及重塑。因此我們推測，血府逐瘀膠囊預(yù)處理重塑腦缺血再灌注后梗死灶可能與參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程相關(guān)，從而得以重塑梗死灶神經(jīng)組織。

綜上所述，血府逐瘀膠囊預(yù)處理可通過增強(qiáng)神經(jīng)元抵抗缺血缺氧能力，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善腦缺血再灌注損傷，這可能是其重塑梗死灶、縮小梗死面積的分子機(jī)制之一。

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