高效液相色譜法測定乳制品中的雙氰胺

陳小珍，陳萬勤，王 瑾，黃麗英，張東雷

（浙江省質(zhì)量檢測科學研究院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310013）

雙氰胺（dicyandiamide，DCD）又稱二氰二胺，分子式為C2N4H4。雙氰胺是一種白色結(jié)晶粉末，可溶于水，是一種重要的有機化工原料，可用于生產(chǎn)三聚氰胺［1］，在醫(yī)藥工業(yè)中也可以用于制取硝酸胍和磺胺類藥物，還可以用于固色劑、黏合劑等［2，3］，農(nóng)業(yè)上用于對肥料的凝固作用，防止肥料流失，對肥料中的硝酸鹽類（如硝酸鉀）、胺類化合物進行中和，減少該類化學物質(zhì)的有害作用［4］。雙氰胺對人體是否有害以及含量多少會對人體產(chǎn)生危害目前尚沒有明確的研究結(jié)論，還需要進行毒理研究。但雙氰胺是含氮量高且性質(zhì)較穩(wěn)定的非蛋白氮物質(zhì)，少量加入不影響食品風味；由于目前國家標準規(guī)定的蛋白質(zhì)測定方法基于凱氏定氮法，樣品中任何含氮物質(zhì)均折算成蛋白質(zhì)含量，因此很可能被不法商家利用，非法添加到食品中。最近在新西蘭奶粉中發(fā)現(xiàn)含有雙氰胺，引起國際社會的廣泛關(guān)注。

當前雙氰胺的檢測方法有高效液相色譜-質(zhì)譜法［5-7］和高效液相色譜法［8-10］，這些方法大多數(shù)是關(guān)于生物醫(yī)藥樣品中雙氰胺的檢測，雙氰胺的色譜保留時間大多數(shù)都在3.0min以內(nèi)，適合于基質(zhì)干凈的生物醫(yī)藥產(chǎn)品；關(guān)于基質(zhì)較復雜的乳制品中雙氰胺的檢測方法僅有少數(shù)報道［11，12］，均為液相色譜-質(zhì)譜法。由于雙氰胺在常規(guī)色譜分離中保留時間短，雜質(zhì)干擾嚴重，難以準確進行定性和定量分析，到目前為止關(guān)于乳制品中雙氰胺的液相色譜-紫外檢測法未見報道。本文建立了乳制品中雙氰胺的高效液相色譜-紫外檢測法，優(yōu)化了前處理方法和高效液相色譜條件。該方法簡便、快速、有效，適用于乳制品中雙氰胺的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、設備和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）；乙腈、甲酸（色譜純，Merck公司）；試驗用水為 Milli-Q超純水。標準物質(zhì):雙氰胺（純度99.4%，Sigma-Aldrich公司）。

雙氰胺標準溶液的配制:準確稱取100mg雙氰胺標準品于100mL容量瓶中，用水溶解，配制成1.0g／L的儲備液。用流動相將標準儲備液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg／L的系列標準溶液。

1.2 色譜條件

液相色譜柱:XBridge Amide柱（250mm×4.6 mm，3.5μm，Waters公司）；柱溫:35℃；進樣量:20μL；流動相:乙腈-水（體積比為90∶10）（含體積分數(shù)為0.2%的甲酸）；流速:1.0mL／min；檢測波長:218nm。

1.3 樣品前處理

稱取固態(tài)、半固態(tài)樣品（奶粉、煉乳等）1g（精確到0.01g）或液態(tài)樣品（純奶、酸奶等）2g（精確到0.01g），置于10.0mL比色管中，固態(tài)、半固態(tài)樣品加入3mL 70℃熱水，液態(tài)樣品加入1mL 70℃熱水充分渦旋2min，置于70℃熱水浴中15min充分溶解提取，冷卻至室溫，渦旋中分3次加入乙腈，每次加入2mL，最后用乙腈定容至10.0mL，渦旋搖勻，取2mL液體至2mL離心管中，以8000r／min離心10min，取1.0mL上清液于50℃下氮氣吹干，用1.0mL流動相溶解，過0.45μm濾膜，濾液供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對雙氰胺標準溶液進行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在218 nm處有最大吸收，確定其檢測波長為218nm。

雙氰胺在C18柱上幾乎無保留。雙氰胺的性質(zhì)和三聚氰胺類似，因此試圖采用與三聚氰胺檢測相同的多種離子對試劑如庚烷磺酸鈉等作為流動相［13，14］，但是沒有達到預期效果?；陔p氰胺的性質(zhì)，采用了XBridge Amide柱作為分離柱。選擇不同比例的乙腈-水作為流動相，對雙氰胺標準溶液進行測定，沒有出現(xiàn)目標物色譜峰，加入少量甲酸后，得到相應的目標物色譜峰。通過實驗最終確定以含0.2%甲酸的乙腈-水（90／10，v／v）作為流動相時，目標峰的峰形和保留時間最佳，并且目標峰的保留時間為5min左右，大大減少了基質(zhì)對目標峰的干擾作用，優(yōu)化條件下的標準溶液色譜圖見圖1。

圖1 雙氰胺的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dicyandiamide a.standard；b.spiked milk sample.

2.2 前處理方法的建立

乳制品基質(zhì)比較復雜，對檢測的主要干擾物為脂肪和蛋白質(zhì)，因此除去脂肪和蛋白質(zhì)的干擾最為關(guān)鍵。綜合考慮采用有機試劑沉淀蛋白質(zhì)，便于后續(xù)樣品的處理。

直接用乙腈進行定容后渦旋超聲提取，發(fā)現(xiàn)回收效果不穩(wěn)定，回收率差異較大，且乳制品中的蛋白質(zhì)往往黏結(jié)成塊狀。推測在乙腈快速加入后，蛋白質(zhì)迅速黏結(jié)包夾了部分雙氰胺。考察了緩慢加入乙腈對蛋白質(zhì)沉淀和回收率的影響。結(jié)果表明，在渦旋條件下，緩慢加入乙腈能有效地防止蛋白質(zhì)迅速黏結(jié)，蛋白質(zhì)呈分散狀態(tài)，回收率高且穩(wěn)定。另外還考察了超聲提取對回收率的影響，結(jié)果表明，在渦旋過程中緩慢加入乙腈后超聲與否不影響提取效果。故本文采用在渦旋過程中緩慢加入乙腈的提取方式。

實驗發(fā)現(xiàn)將上述提取液過微孔濾膜后直接進樣，樣品色譜圖會有很高的溶劑峰。取1.0mL提取液于50℃下氮氣吹干，再用1.0mL流動相溶解，過濾膜，濾液供HPLC分析，則樣品色譜圖中的溶劑峰消失，因此，樣品提取后取1.0mL提取液用氮氣吹干，再用流動相重新溶解樣品，供色譜檢測。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

對雙氰胺的標準溶液進行檢測，以儀器響應的峰面積Y對雙氰胺的質(zhì)量濃度X進行線性回歸，雙氰胺在0.5～50mg／L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝153.87 X＋21.56，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9999。在空白樣品處理液中添加雙氰胺標準品，以S／N＝3確定方法的檢出限，以S／N＝10確定方法的定量限，得到雙氰胺的檢出限為0.2mg／kg，定量限為0.5mg／kg。

2.4 回收率和精密度

對乳粉（經(jīng)確認不含雙氰胺）樣品進行回收率試驗，添加水平分別為1.0、2.0和5.0mg／kg，采用優(yōu)化后的前處理方法對樣品進行處理，每個添加水平重復6次，平均回收率分別為101.0%、96.7%和99.7%，RSD分別為4.8%、4.5%和4.9%（見表1）。

表1 乳制品中雙氰胺的加標回收率（n＝6）Table 1 Recovery of dicyandiamide spiked in dairy products（n＝6）

2.5 實際樣品測定

采用本方法對鮮奶、酸奶、煉乳、乳粉等40批乳制品進行檢測，結(jié)果均未檢出雙氰胺。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜法對乳制品中的雙氰胺進行分析，該方法優(yōu)化了XBridge Amide柱的分析條件，色譜峰保留時間優(yōu)化為5min左右，大大降低了基質(zhì)的干擾，方法簡單快速，準確度和精密度高，適用于各種乳制品中雙氰胺的檢測。采用乙腈作為沉淀劑能有效地沉淀蛋白質(zhì)，消除蛋白質(zhì)干擾，從而保障了該方法對乳制品中雙氰胺分析的準確性。本方法適用于乳制品中雙氰胺的分析和質(zhì)量控制。

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