補(bǔ)腎活血方對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠TGF-β1表達(dá)影響的拆方研究

韓麗萍，王相東，魏敏惠，劉 實(shí)，史亞軍，王小寧，方改英，張小琴

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046;2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 寶雞 721000)

前期實(shí)驗(yàn)［1，2］表明，補(bǔ)腎活血中藥仙鹿壯骨方能提高骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度和I型膠原基因表達(dá)，改善骨組織形態(tài)，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥具有良好效果。為進(jìn)一步探討該方不同配伍之間對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用及其配伍規(guī)律，我們對(duì)仙鹿壯骨方進(jìn)行拆方研究，分別檢測(cè)該方君臣佐各組藥物組合對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度、轉(zhuǎn)化生長因子的影響，并將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及分組

選用4月齡SD雌性大鼠153只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，動(dòng)物級(jí)別:二級(jí)，合格證號(hào)醫(yī)東字第08005 號(hào))，體質(zhì)量200 ～250g，隨機(jī)分為13 組:1、君臣大劑量組;2、君臣小劑量組;3、君佐大劑量;4、君佐小劑量組;5、臣佐大劑量組;6、臣佐小劑量組;7、佐藥大劑量組;8佐藥小劑量組;9、全方大劑量組;10、全方小劑量組;11、西藥組;12、模型組;13、空白組。

1.2 藥物來源及分組

仙鹿壯骨方由淫羊藿20g、菟絲子10g、鹿角膠5g、杜仲 10g、骨碎補(bǔ) 10g、三七 3g、山楂 10g 組成。該方君藥為淫羊藿、菟絲子;臣藥為:鹿角膠、骨碎補(bǔ)、杜仲;佐藥為:三七、山楂。隨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行相應(yīng)分組。各組藥物由陜西中醫(yī)學(xué)院制劑室按照實(shí)驗(yàn)要求及制藥標(biāo)準(zhǔn)制備。

造模所用的地塞米松磷酸鈉注射液，由湖北天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字:H42020019，產(chǎn)品批號(hào):20051109。西藥:新蓋中蓋高鈣片，哈藥集團(tuán)制藥六廠，批號(hào):20060116-2。麻醉劑:鹽酸氯胺酮注射液，福建古田藥業(yè)有限公司(批號(hào)050504，規(guī)格:2ml:0.1g)。

1.3 主要試劑與儀器

血清骨鈣素(BGP)放免藥盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心提供;放射免疫測(cè)定用美國Roche公司Elecsys2010檢測(cè)儀器;HPIAS-1000型高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng)，CCD130萬像素?zé)晒怙@微鏡，XSY-I型號(hào)，重慶光學(xué)儀器廠提供;骨密度檢測(cè)用 QDR-2000型雙光能X線骨密度儀，美國HOLOGIG公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 給藥方法

除空白組外，其余組均以地塞米松0.1mg/100g，每周2次肌肉注射造成骨質(zhì)疏松模型。中藥實(shí)驗(yàn)組大鼠，分別按照分組，用中藥湯劑灌胃。具體用量見表1、表2;西藥組以10IU/100g新蓋中蓋藥液灌胃，每日1次，加維生素D 3肌肉注射6萬U/kg，每2周1次。模型組和空白組以1ml/100g蒸餾水灌胃，每日1次。用藥觀察12周后全部處死取材。

2.2 檢測(cè)方法和指標(biāo)

2.2.1 骨密度檢測(cè) 取動(dòng)物一側(cè)股骨連同膝關(guān)節(jié)，送第四軍醫(yī)大學(xué)骨科研究室檢測(cè)骨密度;

2.2.2 轉(zhuǎn)化生長因子檢測(cè)(TGF-β1) 在膝關(guān)節(jié)處取材、固定，PBS漂洗、脫鈣、漂洗、包埋，切取5um厚組織裱于APES包被過的載玻片上。37℃烤干，－20℃存放，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察TGF-β 表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 骨密度值

表1顯示，模型組BMD降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);用中西藥治療后，各組骨密度均有提高(P＜0.05);全方大劑量、君臣大劑量與西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，全方組與君佐及佐藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);君臣組與佐藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中全方大小劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組骨密度值BMD值(g/cm2)

3.2 TGF-β1在大鼠股骨組織中表達(dá)情況

表 2 TGF-β1表達(dá)情況

表2顯示，模型組 TGF-β1值明顯降低，說明造模成功;治療組中大部分和模型組比較(P＜0.05)，說明治療有效果;全方大劑量組與臣佐大劑量組、佐藥大劑量組比較(P＜0.05)，說明全方大劑量組效果明顯優(yōu)于以上2組;全方大劑量組和西藥組比較(P＞0.05)，說明全方大劑量組和西藥效果相當(dāng)。

4 討論

TGF-β1是調(diào)控骨代謝最為重要的細(xì)胞因子，也是骨組織中含量最豐富的生長因子，主要由成骨細(xì)胞(OB)合成、分泌，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞(OC)之間耦聯(lián)的重要生長因子［3］。它具有刺激間充質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成作用，并抑制破骨細(xì)胞的生成及生物活性［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，治療骨質(zhì)疏松癥的有效藥物可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)中的成骨細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，并抑制 TNF-α 的表達(dá)，間接抑制骨吸收［5］。因此，TGF-β1是骨重建的關(guān)鍵性因子，在骨吸收和骨形成中起重要作用。

仙鹿壯骨方中淫羊藿、菟絲子補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋壯骨為君藥，輔以鹿角膠、骨碎補(bǔ)、杜仲溫補(bǔ)腎陽、滋養(yǎng)精血，以加強(qiáng)補(bǔ)腎養(yǎng)骨之力，三者共為臣藥;三七活血散瘀止痛、山楂活血且健胃導(dǎo)滯，促進(jìn)藥物及營養(yǎng)物質(zhì)的有效吸收，均為佐藥;全方以補(bǔ)腎壯骨為主，活血通脈為輔，補(bǔ)而不滯，疏補(bǔ)相合，共奏促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收之功效。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，淫羊霍苷能顯著提高骨質(zhì)疏松模型大鼠血清E2、腰椎骨密度和骨小梁的骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥的病理形態(tài)學(xué)改變［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在改善骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度效果方面，仙鹿壯骨方全方組 ＞君+佐＞君+臣＞臣+佐＞佐藥組，且全方組存在量效關(guān)系，療效隨劑量增大而增強(qiáng)。提示單純補(bǔ)腎藥與單純活血藥以及補(bǔ)腎加活血藥雖均能改善骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度，但程度上存在明顯差異，以補(bǔ)腎加活血藥配伍效果最好。且后者在提高大鼠骨密度的同時(shí)，其改善骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)效果顯著。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，TGF-β1在全方大劑量組中表達(dá)最多，說明全方要比各拆方部分效果顯著;各拆方組與全方大劑量組比較，只有臣佐大劑量組和佐藥大劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明組方中君藥、臣藥是主要組成部分，是該方發(fā)揮藥效的關(guān)鍵。由此可見，補(bǔ)腎、活血以及補(bǔ)腎加活血藥治療均能提升TGF-β1表達(dá)，但后者療效優(yōu)于單純補(bǔ)腎或單純活血藥。這些都從實(shí)驗(yàn)角度印證了骨質(zhì)疏松癥腎虛與血瘀同時(shí)存在，治療時(shí)須二者兼顧，為總結(jié)治療該病的中藥配伍規(guī)律提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 韓麗萍，魏敏惠，等.仙鹿壯骨方對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠I型膠原基因表達(dá)的影響［J］.陜西中醫(yī)，2006，26(9):1151-1152.

［2］ 韓麗萍，魏敏惠，等.仙鹿壯骨方對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及其形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29(6):43-44.

［3］ 刁迎斌，孫玉倩，等.老年男性骨質(zhì)疏松癥患者血清轉(zhuǎn)化生長因子 B1測(cè)定及其臨床意義［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2007，21(5):317-319.

［4］ 聶宇.轉(zhuǎn)化生長因子β與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(12):1489-1490.

［5］ 甘國興，莫新民.壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)雌鼠骨質(zhì)疏松的療效及機(jī)理研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(2):158-160.

［6］ 劉仕杰，莫新民.淫羊霍苷對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理初步研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(3):271-273.