鼠平臺骨折術(shù)后活血補腎藥物對軟骨退變相關(guān)因子的影響

林梓凌，曾建春，樊粵光，黃永明，孫鴻濤，曾意榮，趙京濤

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，廣州 510405)

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎是骨性關(guān)節(jié)炎的一種類型［1］，由骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷骨折后等原因引起。為探討運用中醫(yī)活血補腎方藥，能否有效影響關(guān)節(jié)骨折術(shù)后的軟骨損害病變相關(guān)因子，抑制軟骨退變，我們通過動物實驗進(jìn)行了以下觀察研究。

1 實驗與用藥

1.1 實驗準(zhǔn)備

選擇成年雌性SD大鼠40只(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供)，體質(zhì)量約0.35 ～0.45 kg，隨機分成正常組、中藥觀察組、對照觀察組和空白組，每組10只。

1.2 動物造模

除空白組外均進(jìn)行雙側(cè)造模。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% 的硫賁妥鈉(2 ml/kg體質(zhì)量)腹腔內(nèi)注射麻醉，術(shù)區(qū)消毒后，無菌狀態(tài)下于脛骨結(jié)節(jié)外側(cè)切開顯露脛骨近端，以微型骨鑿縱行劈開脛骨平臺外側(cè)髁。復(fù)位后，自大鼠脛骨平臺外側(cè)插入一枚事先消毒好直徑0.8mm的克氏針，平行關(guān)節(jié)面橫穿脛骨平臺，針尾彎曲埋于平臺皮下。術(shù)后不限制活動，10萬級無菌動物實驗室分籠飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)室溫度為20±1℃，濕度為55±2%。

1.3 藥物準(zhǔn)備

中藥觀察組給予活血補腎方(關(guān)節(jié)康組方加減)［2］湯劑口服(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥室提供)。原方由熟地、川牛膝、杜仲、丹參、川芎、獨活、紅花、木瓜、木香、補骨脂等藥物組成［2］。前5d加桃仁、赤芍、當(dāng)歸，原方熟地改為生地，5d后原方加骨碎補、枸杞子。

對照觀察組給予口服西樂葆，每日1次?？瞻捉M給予生理鹽水，每日1次。所有藥物均按體表面積折算動物的等效劑量，再用生理鹽水配成每天4ml溶液灌胃。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 標(biāo)本采集 分別于術(shù)后3d、7d及21d大鼠眼角取血，離心后取上清液置－70℃保存待測。

1.4.2 TNF-а水平及MMP-3濃度檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 NO測定 用硝酸還原酶法，測定方法參照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間均數(shù)比較行t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，用雙變量相關(guān)分析法分析患者與血清中MMP-3、TNF-а之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中TNF-а、MMP-3水平檢測結(jié)果

表1、2顯示，3d中藥觀察組、空白組及對照觀察組血清TNF-а、MMP-3水平顯著高于空白組(P＜0.01)。中藥觀察組、空白組及對照觀察組3d、7d和21dTNF-а水平有逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);空白組3d、7d和21d MMP-3水平同樣呈逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);但是中藥觀察組和對照觀察組MMP-3的3d和7d TNF-а水平雖然也有升高趨勢，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，而7d和21d則差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同時在7d和21d的對比中，空白組血清TNF-а、MMP-3水平顯著高于中藥觀察組 (P＜0.01)。而對照觀察組在7d時與中藥觀察組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與空白組比較差異明顯(P＜0.01);反之，21d時對照觀察組與中藥觀察組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.2 大鼠血清NO濃度檢測結(jié)果

表3顯示，3d中藥觀察組、空白組及對照觀察組血清NO濃度水平顯著高于空白組 (P＜0.05)?？瞻捉M3d、7d和21dNO濃度同樣呈逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);但是中藥觀察組和對照觀察組NO濃度的3d和7d雖然也有升高趨勢，但兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，而7d和21d差異則有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時在7d和21d的比較中，空白組血清NO濃度顯著高于中藥觀察組 (P＜0.05)，而對照觀察組在7d時與中藥觀察組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與空白組比較差異明顯(P＜0.05);反之，21d時對照觀察組與中藥觀察組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

表1 血清TNF-а水平比較(pg/ml)

表2 血清MMP-3水平比較(ng/ml)

表3 大鼠血清中NO濃度比較

3 討論

高能量損傷骨折致關(guān)節(jié)軟骨的破壞及退變，是創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的主要病理變化。

脛骨平臺骨折屬中醫(yī)“骨折”范疇，而內(nèi)固定術(shù)后創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生、功能障礙可歸屬痹證等范疇。骨折外傷，脈絡(luò)受阻，氣滯則痛，血瘀則腫，致使氣滯血瘀、氣血不通、榮養(yǎng)不利則關(guān)節(jié)屈伸不靈，活動受限。骨折恢復(fù)期肝腎氣血主之，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)則恢復(fù)緩慢，失榮則痛，所謂“膝痛無有不因肝腎虛者”也，因此氣血瘀阻、肝腎虧虛乃是平臺骨折術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)愈合階段的主要表現(xiàn)。

應(yīng)用活血補腎方藥治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究證實［3］，軟骨退變有良好的防治作用。如活血藥當(dāng)歸、川芎和丹參能有效降低骨性關(guān)節(jié)炎中炎癥因子水平，保護(hù)和促進(jìn)軟骨細(xì)胞修復(fù)，防治關(guān)節(jié)軟骨退變［4～8］。應(yīng)用活血補腎方藥在動物實驗中證明有一定的鎮(zhèn)痛作用，能減輕藥物損傷所致大鼠足跖腫脹的作用及部分抗炎功效［9］。

在補腎藥物方面，汪青春等［10，11］發(fā)現(xiàn)補腎方藥對延緩軟骨降解效果較好，可增強SOD的活性，降低血清HA水平，抑制軟骨GAG的降解，輕度下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨IL-、iNOS的基因表達(dá)，對IL-6有輕度上調(diào)作用;且能增加軟骨細(xì)胞功能，對受破壞的軟骨修復(fù)似有一定作用。曾意榮等認(rèn)為［12］，活血補腎復(fù)方中藥能顯著降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清MMP-3的水平，間接預(yù)防II型膠原總量丟失，顯著降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清IL-1水平，顯著降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清透明質(zhì)酸水平，顯著提高超氧化物歧化酶活性，降低乳過氧化物酶活性，清除氧自由基。

通過我們的動物實驗可見，關(guān)節(jié)骨折術(shù)后早期，運用活血補腎方藥的中藥觀察組血清MMP-3水平顯著低于對照組，可以認(rèn)為活血補腎方藥能在治療早期便有效抑制MMP-3水平的增高。而在中期，中藥觀察組血清TNF-а、MMP-3和NO的水平均顯著低于對照組，說明應(yīng)用活血補腎法的中藥觀察組對這期間相關(guān)檢測因子指標(biāo)的水平增長能有效抑制。TNF-a、MMP-3和NO等因子都是關(guān)節(jié)軟骨損害過程中重要的誘發(fā)、介導(dǎo)因子，它們在血清和關(guān)節(jié)液中的濃度水平高低，可反映關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程。因此，根據(jù)動物實驗室檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中藥觀察組對關(guān)節(jié)骨折固定術(shù)后的血清TNF-a、MMP-3和NO水平增長能有效抑制，證明運用活血補腎方藥辨證施治用藥，能有效防治關(guān)節(jié)骨折術(shù)后軟骨退變進(jìn)程。

綜上研究所示，辨證應(yīng)用活血補腎藥物對于抑制脛骨平臺骨折術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程的相關(guān)因子水平，防治創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了積極有利的影響。

［1］ 許學(xué)猛，王羽豐，鄧晉豐，等.活血補腎膠囊影響兔膝關(guān)節(jié)退行性疾病骨內(nèi)高壓變化的實驗研究［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2001，9(4):24-26.

［2］ 周斌，樊粵光，曾意榮.中藥關(guān)節(jié)康治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，23(6):476-480.

［3］ 許學(xué)猛，王羽豐，鄧晉豐，等.活血補腎膠囊影響兔膝關(guān)節(jié)退行性疾病骨內(nèi)高壓變化的實驗研究［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2001，9(4):24-26.

［4］ 王文璜，劉宏澤，衛(wèi)小春，等.川芎嗪防治膝關(guān)節(jié)軟骨退變的實驗研究［J］.中國骨傷，2004，17(2):80-83.

［5］ 晏雪生，彭亞琴，明安萍.川芎嗪注射液對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞影響的實驗研究［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2002，10(1):51-54.

［6］ 呂紅斌，岳珍，王嘉美，等.四種中藥對體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝的影響［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1995，14(3):135-138.

［7］ 王耶，劉建宇，宋艷，等.丹參和透明質(zhì)酸鈉注射液對骨性關(guān)節(jié)炎治療作用的實驗研究［J］.中國生化藥物雜志，1998，19(5):248-251.

［8］ 王秀華，劉元祿，蘇姿兵，等.丹參關(guān)節(jié)內(nèi)注射對兔膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子 IL-I及 TNF的影響［J］.中醫(yī)正骨，2003，15(10):1-4.

［9］ 王麗新，鄒衍衍，樊粵光.關(guān)節(jié)康片的抗炎鎮(zhèn)痛作用及毒性觀察［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16(6):417-420.

［10］ 汪青春，董蕙芳，沈墻芝，等.中藥對膝骨關(guān)節(jié)炎黑鼠血清SOD、HA、NO 水平的影響［J］.中醫(yī)正骨，1999，11(5):6-8.

［11］ 汪青春，石印玉，沈墻芝，等.中藥對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨IL-I、NOS基因表達(dá)的影響［J］.山西醫(yī)藥雜志，1999，28(5):381-384.

［12］ 曾意榮，樊粵光，吳凡，等.膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶3、腫瘤壞死因子Q、白細(xì)胞介素1、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)過氧化物含量及超氧化物歧化酶活性變化與活血補腎中藥的干預(yù)［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(28):2436-2439.