不同破碎方法提取嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的研究

張 帥

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150040)

嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中極為重視研究與開(kāi)發(fā)的益生菌之一，被視為第3 代酸乳發(fā)酵劑菌種，它是人體腸道中的重要微生物，與人體健康息息相關(guān)［1］.當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，可以起到健康促進(jìn)效果.嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能抑制大腸桿菌DNA 合成，能有效地抑制廣譜性革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和真菌產(chǎn)生的毒性氧化代謝物［2］，其應(yīng)用前景越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注，然而在細(xì)菌素的研究中仍存在許多問(wèn)題，例如細(xì)菌素的分離提取.

自20世紀(jì)80年代初以來(lái)，生物技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，生物產(chǎn)品的數(shù)量越來(lái)越多，許多具有重大應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生［3］.很多產(chǎn)物都是來(lái)源于微生物胞內(nèi)物質(zhì)，分離提取這類產(chǎn)物時(shí)，必須將細(xì)胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取.因此細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟，破碎技術(shù)的研究更加引起基因工程專家和生化工程學(xué)者的關(guān)注［4］.

1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

嗜酸乳桿菌(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院提供)，大腸桿菌，蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，葡萄糖，桔子汁，乙酸鈉，檸檬酸二銨，油酸，吐溫80，K2HPO4，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉，蒸餾水(均為分析純).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DL－5－B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)隔音箱(寧波新芝生物科技股份有限公司);SP－721E 可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);DHP－9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);HD－1630 超凈操作臺(tái)(哈爾濱儀器五廠);DHG－9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);THZ－82A 恒溫培養(yǎng)振蕩器(江蘇榮華儀器制造有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 嗜酸乳桿菌的活化

實(shí)驗(yàn)室保藏的嗜酸乳桿菌菌種處于休眠狀態(tài)，將其活化.在超凈操作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌移液管移取2 mL 嗜酸乳桿菌菌懸液，接入到裝有滅過(guò)菌的100 mL MRS 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，待用.

將活化后的嗜酸乳桿菌菌種按2%接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).在超凈操作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌移液管吸取4 mL 活化后的嗜酸乳桿菌菌懸液，接種到裝有滅過(guò)菌的100 mL 增培培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，待用［5－6］.

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

在無(wú)菌平皿中倒入融化后并滅過(guò)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂(4.5%)，充分冷卻凝固后，吸取稀釋度為10－2的大腸桿菌菌懸液0.1 mL 涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，再用無(wú)菌鑷子夾取滅過(guò)菌的牛津杯放在含有指示菌的培養(yǎng)基上，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h.觀察抑菌圈，并測(cè)其直徑大小.

2.3 微波法對(duì)分離細(xì)菌素的影響

分別對(duì)20 mL 擴(kuò)培后的嗜酸乳桿菌菌液微波處理2、4、6、8、10 min，每次間歇用流水冷卻，將破碎后的發(fā)酵液于4 800 r/min 離心機(jī)中離心30 min.菌體沉淀?xiàng)壢?收集上清液作抑菌實(shí)驗(yàn).

2.4 珠磨法對(duì)分離細(xì)菌素的影響

分別添加20個(gè)玻璃珠于錐形瓶中，置于20℃，各放于60、90、120、150、180 r/min 搖床處理3 h，將破碎后的發(fā)酵液于4 800 r/min 離心機(jī)中離心30 min.菌體沉淀?xiàng)壢?收集上清液作抑菌實(shí)驗(yàn).

2.5 超聲波法對(duì)分離細(xì)菌素的影響

分別于400 W 功率下超聲破碎10、20、30、40、50 min，將破碎后的發(fā)酵液于4 800 r/min 離心機(jī)中離心30 min.菌體沉淀?xiàng)壢?收集上清液作抑菌實(shí)驗(yàn).

2.6 反復(fù)凍融法對(duì)分離細(xì)菌素的影響

在－20 ℃冰箱中分別冷凍5、10、15、20、25 min，，再放入沸水浴中5、10、15、20、25 min，反復(fù)凍融3 次，將破碎后的發(fā)酵液于4 800 r/min 離心機(jī)中離心30 min.菌體沉淀?xiàng)壢?收集上清液作抑菌實(shí)驗(yàn).

2.7 石英砂研磨法對(duì)分離細(xì)菌素的影響

分別加入1、2、3、4、5 g 石英砂于錐形瓶中，研磨20 min，將破碎后的發(fā)酵液于4 800 r/min 離心機(jī)中離心30 min.將上清液與菌體分離，菌體滅菌后棄去.收集上清液作抑菌實(shí)驗(yàn).

3 結(jié)果與討論

3.1 微波法對(duì)分離細(xì)菌素的影響結(jié)果

微波破碎細(xì)胞技術(shù)是基于微波加熱的選擇性、瞬時(shí)性和高效性.通過(guò)對(duì)生物材料進(jìn)行適宜的微波處理而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎的一種細(xì)胞破碎手段.由圖1可知，微波處理8 min 時(shí)，其抑菌圈直徑最大，說(shuō)明此時(shí)抑菌效果較好，故嗜酸乳桿菌菌體采用微波處理8 min 時(shí)，破碎效果較好.

圖1 微波法的抑菌圈直徑

3.2 珠磨法對(duì)分離細(xì)菌素的影響結(jié)果

由圖2 可知，玻璃珠在劇烈的震蕩過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物細(xì)菌素的快速釋放，珠磨處理在120 r/min 時(shí)，其抑菌圈直徑最大，為17.9 mm，抑菌效果較好，即可知120 r/min 時(shí)，嗜酸乳桿菌菌體破碎效果較好.但珠磨法易產(chǎn)生較多的熱量，可能因此增加產(chǎn)物活性的損失.

圖2 珠磨法的抑菌圈直徑

3.3 超聲波法對(duì)分離細(xì)菌素的影響結(jié)果

超聲破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少.由圖3 可知，超聲處理40 min 時(shí)，其抑菌圈直徑最大，抑菌效果較好，即可知40 min 時(shí)，嗜酸乳桿菌菌體破碎效果較好.

圖3 超聲法的抑菌圈直徑

3.4 反復(fù)凍融法對(duì)分離細(xì)菌素的影響結(jié)果

由圖4 可知，多次凍融能增大細(xì)胞壁的通透性，能將胞內(nèi)物質(zhì)釋放.反復(fù)凍融處理20 min 時(shí)，其抑菌圈直徑最大，抑菌效果較好，即可知25 min時(shí)，嗜酸乳桿菌菌體破碎效果較好.

圖4 反復(fù)凍融法的抑菌圈直徑

3.5 石英砂研磨法對(duì)分離細(xì)菌素的影響結(jié)果

由圖5 可知，石英砂研磨處理添加量為4 g時(shí)，其抑菌圈直徑較大，但其透明度不高，可能由于手動(dòng)研磨的緣故，使細(xì)胞無(wú)法完全破壁，胞內(nèi)物質(zhì)不能完全釋放出來(lái).故石英砂加入量為4 g 時(shí)，嗜酸乳桿菌菌體破碎效果較好.

圖5 石英砂研磨法分離細(xì)菌素的抑菌效果

3.6 五種方法抑菌圈平均直徑對(duì)比圖

由圖6 可知，實(shí)驗(yàn)的5種物理方法微波法、珠磨法、超聲波法、反復(fù)凍融法、石英砂研磨法中，超聲波破碎法抑菌圈平均直徑最大，嗜酸乳桿菌菌體破碎效果最好.

圖6 五種方法的抑菌圈平均直徑

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)以嗜酸乳桿菌為菌種，采用對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞破碎分離細(xì)菌素的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)抑菌效果對(duì)比分析，研究得出最佳細(xì)胞破碎方法.結(jié)果表明，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)，超聲波法在超聲破碎30 min 時(shí)，抑菌圈平均直徑達(dá)到最大，細(xì)胞破碎效果最好.其他依次為微波法、珠磨法、反復(fù)凍融法，石英砂研磨法.

［1］單春?jiǎn)蹋瑒⑶锍?，?洋，等.嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素生物學(xué)特性的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2009，2(1):90－93.

［2］鄭 虹.Bacillus subtilis FB123所產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化及表征［D］.福州:福建師范大學(xué)，2006.

［3］葉 巍，霍貴成.乳酸菌細(xì)菌素應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006，2:56－58.

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［5］樊明濤，楊 媛.嗜酸乳桿菌增菌培養(yǎng)基的研究［J］.食品工業(yè)科技，2000，5(2):25－27.

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