HPLC法測定壯心口服液中柚皮苷和橙皮苷的含量

王希東，李文俊，王秀琴

壯心口服液是371醫(yī)院根據(jù)慢性心力衰竭發(fā)病機理及臨床特點，采用辨病與辨證相結(jié)合，用藥劑量與心衰程度相結(jié)合，組方采用君、臣、佐、使，研制出的一種口服液。壯心口服液重用人參補氣回陽、莪術(shù)活血共為君，葶藶子消腫行水為臣，枳實消痞除積為佐，茯苓健脾祛濕利水為使。具有補氣活血、祛濕利水之功，用于冠心病、高血壓性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、肺原性心臟病及心肌病等引起的心功能不全。為有效控制藥品質(zhì)量，本試驗參照相關(guān)文獻，以枳實中的柚皮苷和橙皮苷為質(zhì)控成分，采用HPLC法進行了含量測定方法的研究[1，2]。結(jié)果表明，該法操作簡便、快速、重現(xiàn)性好，為壯心口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津-高效液相色譜儀，島津LC-10ATVP泵，SPD-10A VP紫外檢測器，77251自動進樣器，N2000雙通道色譜工作站；AS3120A超聲波清洗器；AL104電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。柚皮苷對照品（含量測定用，批號110722-200309）和橙皮苷對照品（含量測定用，批號110721-200512）由中國藥品生物制品檢定所提供；壯心口服液由解放軍第371醫(yī)院制劑室提供。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱C18（2）5μ 150×4.6 mm柱； 流動相：乙腈-0.05%磷酸（20∶80）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：284 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20μl。

2.2 對照品溶液的制備 分別取柚皮苷和橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別配制成含柚皮苷680μg/ml和橙皮苷 160 μg/ml的對照品母液。 分別精密量取 1、3、5、7、9 ml對照品母液置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 68、204、340、476、612 μg/ml的柚皮苷對照品溶液和濃度為 16、48、80、112、144 μg/ml的橙皮苷對照品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取上述稀釋好的對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以測得的峰面積積分值為縱坐標、進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。柚皮苷回歸方程：y=3E+06x-1E+06，r=0.9998線性范圍為1.36～12.24μg；橙皮苷回歸方程：y=6.48E+05x-2.97E+05，r=0.9997線性范圍為 0.32～2.88μg，結(jié)果表明：柚皮苷和橙皮苷進樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 供試品溶液的制備 精密量取壯心口服液樣品5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5 陰性對照試驗 取去枳實的陰性制劑，按“2.4”項下方法制備供試液，按上述色譜條件測定。結(jié)果陰性對照溶液在與橙皮苷和柚皮苷相同保留時間處，無色譜峰出現(xiàn)。表明陰性樣品無干擾，此方法具有專屬性。色譜圖見圖1～4。

圖 1 柚皮苷對照品圖譜

圖 2 橙皮苷對照品圖譜

圖 3 壯心口服液圖譜

圖 4 陰性樣品圖譜

2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進樣5次，20μl/次，結(jié)果柚皮苷峰面積的RSD＝0.33%（n＝5），橙皮苷峰面積的 RSD＝0.27%（n＝5）。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別在 0、2、4、6、8 h進樣，測得柚皮苷峰面積的 RSD＝0.95%（n＝5），橙皮苷峰面積的 RSD＝1.34%（n＝5），結(jié)果表明在測定條件下，供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 按上述“供試品溶液的制備”方法，對同一批樣品分別制備5份供試品溶液，按 “樣品含量測定”項下，各吸取20μl進樣測定，結(jié)果柚皮苷平均含量為1.93 mg/ml，RSD為 1.18%； 橙皮苷平均含量為 0.39 mg/ml，RSD為1.65%。

2.9 回收率試驗 精密量取已知含量的樣品2.5 ml，6份分別精密加入柚皮苷對照品溶液（680 μg/ml）8.5、7、5.5 ml；另取6份分別精密加入橙皮苷對照品溶液 （160μg/ml）7、6、5 ml。按上述“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，按“樣品含量測定”項下，各吸取20μl進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表 1、2。

表 1 柚皮苷回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品測定 取不同批號的樣品，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，按外標法，用峰面積計算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇 參照相關(guān)參考文獻[3，4]，試驗中以甲醇-水-醋酸、甲醇-水-磷酸為流動相時，峰形差，柚皮苷和橙皮苷的分離度太低，效果不理想。通過試驗比較，采用乙腈-0.05%磷酸為流動相時，柚皮苷和橙皮苷的分離度>1.5，效果較理想。

表 2 橙皮苷回收率試驗結(jié)果

表 3 壯心口服液中柚皮苷和橙皮苷的含量

3.2 枳實中含有多種黃酮苷[5]本試驗在同一色譜條件下同時測定柚皮苷和橙皮苷，分離效果良好，方法簡單易行，專屬性、精密度、重現(xiàn)性、準確度均較好，可作為壯心口服液質(zhì)量控制的有效方法。

[1]崔宇宏，常海萍，史憲海.對枳殼中柚皮苷含量測定方法的改進[J]. 中國藥品標準，2005，6（1）：46.

[2]楊武亮，楊世林，張 敏，等.RP-HPLC法測定枳殼中柚皮苷和新橙皮苷的含量[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2005，16（4）：261.

[3]付超美，鄒 亮，錢 妍，等.HPLC測定健脾消食顆粒中橙皮苷的含量[J]. 華西藥學(xué)雜志，2004，19（4）：299.

[4]丁桂蘭，薛亞光，邢春來，等.HPLC測定橘紅丸中柚皮苷、橙皮苷的含量[J]. 中成藥，2004，26（9）：707.

[5]劉振麗，宋志前，張 玲，等.枳實飲片中3類化學(xué)成分含量測定[J]. 中國中藥雜志，2006，31（17）：1425-1427.