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    黃芪對喉癌細胞增殖和凋亡的影響

    2013-10-16 01:15:42劉秀萍白偉良季文樾
    實用藥物與臨床 2013年1期
    關(guān)鍵詞:光鏡喉癌抑制率

    宋 巖,劉秀萍,白偉良,季文樾

    隨著分子生物學、細胞生物學、腫瘤學等相關(guān)生命學科的迅猛發(fā)展,喉癌的化療藥物研究也進入了一個新階段[1]。近年來國內(nèi)外研究表明,清熱類中藥黃芪可通過調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝,誘導腫瘤細胞周期停滯及細胞凋亡,抑制腫瘤新生血管生成,抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等發(fā)揮其抗腫瘤作用[2]。文獻報道其在膀胱癌、胃癌治療方面作用顯著,但在喉癌治療中的研究甚少,本文就黃芪對喉癌細胞增殖和凋亡的影響進行了研究,現(xiàn)報道如下。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料 細胞株:喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞株購自中國科學院細胞庫。試劑:黃芪注射液購自正大青春寶集團;Annexin V凋亡檢測試劑盒購自凱基公司;MTT、碘化丙啶(Proidum iodide,PI)、二甲基亞楓(DimethyI sulfoxide,DMSO)等購自北京鼎國生物公司;TMPI-1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司;RnaseA購于碧云天;標準胎牛血清購自杭州四季青公司;青鏈霉素、磷酸鹽緩沖溶液(Phophate buffered saline,PBS)購自上海生工生物有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),加100 U/mL青霉素,100 U/mL鏈霉素37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng),48 h傳一代,取對數(shù)生長期用于實驗。

    1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期Hep-2細胞,常規(guī)胰酶消化,調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105個/L,接種于96孔板,貼壁24 h后,換成含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液,每組3個復孔,作用24 h后,加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,震蕩10 min,待紫色結(jié)晶完全溶解后,用酶標試儀測定490 nm處吸光度(A)值繪制生長曲線,觀察藥物抑制細胞生長情況。細胞增殖抑制率=(1-加藥孔細胞A值/對照孔細胞A值)×100%。

    1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將適當濃度的對數(shù)生長期Hep-2細胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24 h,吸出培養(yǎng)基,加入含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液,分別作用24 h,收集 1×106個細胞,1 000 r/min離心10 min,PBS洗1次,4℃、75%冰乙醇固定24 h,PBS洗3次,上機前加入PI冰浴避光放置1 h,調(diào)整細胞濃度到1×106個/L,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率,如此重復3次。

    1.2.4 細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期細胞,每瓶4×105接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)過夜,待細胞貼壁后,按“1.2.3”項方法分組處理各組細胞,繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h后,應用光學倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài),并隨機拍照。

    1.2.5 Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài)變化將預處理過的蓋玻片置于6孔板內(nèi),Hep-2細胞密度調(diào)整為5×105/mL,各取1 mL種入6孔板培養(yǎng)過夜,使細胞長至60%~80%。給藥組加入200 μg/mL的黃芪培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,吸盡培養(yǎng)液,加入固定液0.5 mL固定15 min,PBS洗2次,加1 mL Hoechst 33258熒光染液,避光10 min,封片后熒光顯微鏡觀察,照相,見圖1。

    圖1 Hoechst 33258熒光染色法觀察黃芪作用前后細胞形態(tài)學變化

    1.3 統(tǒng)計學分析 采用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù),SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用表示,兩組之間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT檢測黃芪對Hep-2細胞生長的抑制作用 通過繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn),黃芪可抑制Hep-2細胞生長,并且隨著藥物濃度增加其生長抑制率也增加,兩者存在濃度相關(guān)性。見表1。

    表1 不同濃度黃芪作用24 h后抑制率、凋亡率比較(%)

    2.2 黃芪對喉癌Hep-2細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),黃芪具有誘導喉癌Hep-2細胞凋亡的作用,細胞凋亡發(fā)生率隨黃芪濃度增加而明顯增加。結(jié)果見表2。

    表2 不同濃度黃芪作用24 h后細胞各周期分布(%)

    2.3 光鏡觀察 由倒置相差顯微鏡可以觀察到,與未經(jīng)處理的對照組相比,干預組都有不同程度的形態(tài)改變,見圖2。

    2.4 Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察 200 μg/mL黃芪作用于Hep-2細胞24 h后,細胞發(fā)生顯著性形態(tài)學改變,出現(xiàn)大量染色質(zhì)邊聚,細胞核固縮,甚至可見核碎裂、核溶解特征性表現(xiàn)。凋亡的細胞隨著黃芪濃度的增加明顯增多,最后大片細胞脫落,可觀察到細胞脫失區(qū),結(jié)果見圖2。

    圖2 光鏡下觀察黃芪作用前后Hep-2細胞形態(tài)學變化

    3 討論

    喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,在中國東北發(fā)病率較高,近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)也呈上升趨勢。目前,在放化療和外科手術(shù)聯(lián)合治療的情況下,Tis、T1及T2期喉癌治療有效率為80%~90%,而T3、T4期喉癌只有40%~50%。盡管外科手術(shù)和放化療技術(shù)有了明顯進步,但患者的5年生存率仍沒有提高,原因是多方面的,其中對發(fā)病機制研究不夠完善、沒有明確的治療靶點是最關(guān)鍵的原因。

    本研究表明,黃芪具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。MTT檢測結(jié)果表明,黃芪可抑制Hep-2細胞,且隨著藥物濃度增加其生長抑制率也增加,兩者存在濃度依賴關(guān)系。濃度為20、100、200 μg/mL時,抑瘤率分別為35.38% ±0.17%、59.12% ±0.21%、84.55% ±0.27%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。抑制率隨濃度增加而逐漸上升,到 200 μg/mL時,其抑制率達84.55% ±0.27%,抑瘤作用顯著,由此推斷黃芪可以在體內(nèi)外發(fā)揮對喉癌的抑制作用。筆者用流式細胞儀檢測不同濃度黃芪作用Hep-2細胞后引起的細胞凋亡率的變化,發(fā)現(xiàn)20 μg/mL時凋亡率為38.2% ±1.3%,100 μg/mL時凋亡率為 87.2% ±1.7%,200 μg/mL濃度時凋亡率為94.6% ±1.3%,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義,并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,說明黃芪可有效促進喉癌Hep-2細胞凋亡。

    筆者采用光鏡與免疫熒光染色對給藥前后喉癌Hep-2細胞進行微觀對比,發(fā)現(xiàn)光鏡下黃芪作用細胞24 h后,隨著黃芪濃度的增加,細胞變圓,不規(guī)則,細胞數(shù)目明顯減少,細胞間隙變大;熒光染色下,細胞出現(xiàn)核碎裂,核仁消失,染色質(zhì)固縮,可見凋亡細胞,嚴重時成片細胞脫落。對照組喉癌Hep-2細胞生長良好,細胞形態(tài)圓,胞膜表面光滑,無凋亡發(fā)生。

    黃芪為多年生草本植物,主要成分為黃酮,如黃芪素。研究發(fā)現(xiàn),黃芪素可下調(diào)bcl-2表達,上調(diào)Bax表達,通過細胞色素C-線粒體-Caspase-3途徑誘導乳腺癌細胞凋亡[3]。Roy等[4]發(fā)現(xiàn),小劑量黃芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60細胞大量停滯于S或G2/M期,而大劑量黃芪素則誘導細胞凋亡。黃芪具有誘導多種腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等特點,但其抗腫瘤機制復雜多樣,尚未完全明確[5]。筆者用不同濃度的黃芪進行體外抑癌實驗,應用不同方式檢測不同濃度黃芪對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的促凋亡作用,發(fā)現(xiàn)黃芪體外作用人喉癌Hep-2細胞后,可抑制腫瘤細胞生長,促進其凋亡以達到抗癌作用,但具體機制有待進一步研究。

    [1]Tsai YS,Lee KW,Huang JL,et al.Arecoline,a major alkaloid of areca nut,inhibits p53,represses DNA repair,and triggers DNA damage response in human epithelial cells[J].Toxicology,2008,249(2-3):230-237.

    [2]毛捷,徐善水,盛莉莉,等.黃芪素的抗腫瘤作用及機制的研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學,2009,14(10):1178-1182.

    [3]Lee JH,Li YC,Ip SW,et al.The role of Ca2+in baicalein induced apoptosis in human breast MDA-MB-231 cancer cells through mitochondria and caspase-3-dependent pathway[J].Anticancer Res,2007,27(1A):117-125.

    [4]Roy MK,Nakahara K,Na TV,et al.Baicalein,a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis[J].Pharmazie,2007,62(2):149-153.

    [5]王曉瑜,龍漢安.黃芪及黃酮類成分防治腫瘤作用的研究進展[J].華西醫(yī)學,2011,26(2):297-300.

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